化瘀通絡中藥對肝纖維化大鼠的治療作用及其對血小板衍生生長因子(PDGF)及Ras信號傳導通路的影響.pdf

1、目的:肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的一個動態(tài)過程及共同病理途徑,是肝臟纖維結締組織過度沉積的結果。肝纖維化是機體對慢性損傷的主動性修復反應,以肝臟細胞外基質(Extra-cellular matrix,ECM),的增生與沉積為特征,形態(tài)上表現(xiàn)為肝竇毛細血管化與肝小葉內(nèi)纖維化,功能上可引起肝功能減退、門靜脈高壓等,甚至發(fā)展成為肝癌,嚴重影響患者的生命健康。因此,及時治療阻斷肝纖維化的進一步發(fā)

2、展意義重大。很多細胞因子參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,血小板衍生生長因子(Platelet derivative growth factor,PDGF)是已知的最強的促肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖分化的細胞因子,它能夠強烈刺激HSC的增殖、遷移,轉化為肌成纖維細胞,促使膠原產(chǎn)生、沉積,在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中意義重大。國內(nèi)外學者對肝纖維化的發(fā)病機制進行了大量研究,但臨床上阻斷肝纖維化仍是一個難題,近年來

3、開展的中醫(yī)藥抗肝纖維化的臨床和基礎研究顯示了一定的優(yōu)勢和較大的潛力。化瘀通絡中藥鱉甲煎丸出自張仲景《金匾要略》,具有化瘀通絡、。軟堅散結之功效,攻補兼施,作用全面。大量實驗證實,鱉甲煎丸應對肝纖維化的復雜病機可通過多途徑、多靶點的發(fā)揮中醫(yī)藥抗肝纖維化的作用。本研究通過對SD大鼠采用皮下注射四氯化碳(CCL4)的方法建立肝纖維化大鼠模型,應用化瘀通絡中成藥鱉甲煎丸對該模型進行干預,通過觀察實驗動物的一般情況,檢測血清層粘連蛋白(LN)、Ⅳ

4、型膠原(Col-Ⅳ),血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血清白蛋白(ALB)的含量,觀察肝臟病理學形態(tài),檢測肝組織PDGF水平,肝組織Ras、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase,ERK1)水平,探討化瘀通絡中藥對肝纖維化的防治作用及其可能作用機制,為臨床上治療以“氣陰兩虛、瘀血阻絡”為基本病因病機的“癥積”提供實驗依據(jù)。
　　 方法:

5、清潔級健康雄性SD大鼠48只,體重280-320g,適應性飼養(yǎng)一周后按體重隨機分為正常對照組(Control)、模型組(Model)、西藥組(Thewestern medicine group,簡稱XY)、化瘀通絡中藥低劑量組(Low dosetreated)簡稱ZY(L)、中劑量組(Middle dose treated)簡稱ZY(M)、高劑量組(High dose treated)簡稱ZY(G)。除正常組外,模型組、中藥各組、西藥組

6、均于實驗第1天每只大鼠皮下注射40％CCl4花生油5ml/kg,此后每3天注射3ml/kg,同時從實驗第一天起,中藥各組分別給予化瘀通絡中藥低、中、高劑量組大鼠鱉甲煎丸0.55g/(kg.d)、1.1 g/(kg.d)、2.2g/(kg.d)灌胃,西藥組給予秋水仙堿0.3mg/kg灌胃,每日一次。從實驗第四周末開始,每周末隨機處死模型組大鼠,光鏡下觀察肝臟病理學改變,實驗第6周造模成功。造模成功后給予中藥各組大鼠及西藥組大鼠繼續(xù)灌胃5周

7、,每日一次。從實驗第一天開始,模型組大鼠給予蒸餾水灌胃,共11周。整個實驗中,正常組大鼠皮下注射等量花生油,并給予蒸餾水灌胃,每日1次,共6周,6周停止皮下注射花生油,繼續(xù)給予蒸餾水灌胃5周。于實驗第11周末,禁食12小時,水合氯醛麻醉,股動脈放血,分離血清,測定血清ALT、AST、ALP、ALB水平;放射免疫法檢測血清LN、Col-Ⅳ水平;摘取大鼠肝臟,留取肝組織,置于4%多聚甲醛固定液中,應用旺染色及Masson染色觀察各組大鼠的肝

8、臟病理形態(tài)學變化;留取肝組織于液氮速凍后置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存,反轉錄聚合酶聯(lián)反應(reverse transcription-polymerase chainreaction RT-PCR)法檢測肝組織中PDGF含量、Ras蛋白水平;免疫組化方法檢測肝組織中ERK1的表達。
　　 結果:
　　 1各組大鼠的一般情況
　　 在實驗過程中,正常組除外,其余各組均有死亡情況:模型組死亡3只,中藥高劑量組死亡1只,

9、中藥低、中劑量組各死亡2只,西藥組死亡3只。正常組大鼠體重呈進行性增長,飲食正常,反應敏捷,眼光有神,毛發(fā)有光澤。其余各組大鼠一般狀況較差,反應遲鈍,皮毛松弛,毛色暗淡,潮濕成縷,其中模型組個別大鼠出現(xiàn)雙目失明,且脾氣急躁易怒,易激惹,形體消瘦。
　　 2各組大鼠肝臟病理形態(tài)學改變
　　 正常組大鼠肝臟形態(tài)正常,包膜完整,色淡紅,切面光滑整齊。肝小葉結構清晰,肝細胞多為單核,肝板呈條索狀,肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列。

10、模型組大鼠,肝臟形態(tài)異常,表面毛糙、質脆,切面有沙粒感。大鼠肝細胞腫脹變大,肝細胞廣泛壞死,肝臟匯管區(qū)擴大及炎細胞浸潤,肝小葉結構破壞,匯管區(qū)纖維結締組織增生明顯,將肝小葉包繞成大小不等的肝細胞團,形成假小葉?；鐾ńj中藥各劑量組肝小葉結構較清晰,肝竇輕度擴張,肝細胞中度壞死,匯管區(qū)纖維結締組織中度增生,假小葉形成明顯較少。西藥組肝臟病理變化介于模型組與中藥組之間。提示,化瘀通絡中藥可改善肝纖維化大鼠的肝臟纖維化程度,且相對于西藥秋水仙

11、堿效果更明顯。
　　 3各組大鼠血清ALT、AST、ALP、ALB水平
　　 各組大鼠血清ALT、AST、ALP含量結果顯示:與正常組相比,模型組、西藥組、中藥低、中劑量組大鼠血清ALT、AST、ALP含量明顯升高(P＜0.05),中藥高劑量組與正常組ALT、AST、ALP含量差異無統(tǒng)計學意義;與模型組相比,中藥各劑量組、西藥組血清ALT、AST、ALP明顯降低(P＜0.05);與西藥組相比,中藥高劑量組血清ALT、AS

12、T、ALP含量明顯減低(P＜0.05),中藥低劑量組含量較高(P＜0.05),中藥中劑量組與之差異無統(tǒng)計學意義;中藥各劑量組之間相比,中藥低劑量組血清ALT、AST、ALP含量高,中藥高劑量組含量最低,中藥中劑量組居中,中藥各劑量組間存在顯著性差異(P＜0.05)。提示,化瘀通絡中藥可明顯降低肝纖維化大鼠血清ALT、AST、ALP水平,有助于肝纖維化的治療。
　　 各組大鼠血清ALB含量的結果顯示:與正常組相比,模型組、西藥組、

13、中藥低、中劑量組大鼠血清ALB含量明顯降低(P＜0.05),中藥高劑量組與正常組差異無統(tǒng)計學意義;與模型組相比,西藥組、中藥高、中劑量組血清ALB含量明顯升高(P＜0.05),中藥低劑量組與之差別無統(tǒng)計學意義;與西藥組相比,中藥高劑量組血清ALB含量明顯升高,中藥低劑量組血清ALB水平降低(P＜0.05),中藥中劑量組與之相比差別無統(tǒng)計學意義;中藥各劑量組間血清ALB水平兩兩比較差異,其中,中藥高劑量組血清ALB含量最高,中藥中劑量組次

14、之,中藥低劑量組含量最低(P＜0.05)。提示,化瘀通絡中藥可使血清ALB水平下降趨勢得到扭轉,有助于肝纖維化的治療。
　　 4各組大鼠血清LN、Col-Ⅳ水平
　　 各組大鼠血清LN、Col-Ⅳ含量結果示:與正常組相比,模型組、西藥組、中藥低、中劑量組大鼠血清LN、Col-Ⅳ含量明顯升高(P＜0.05),中藥高劑量組與正常組差異無統(tǒng)計學意義;與模型組相比,中藥各劑量組、西藥組血清LN、Col-Ⅳ明顯降低(P＜0.05)

15、;與西藥組相比,中藥高劑量組血清LN、Col-Ⅳ含量明顯減低(P＜0.05),中藥低劑量組含量較高(P＜0.05),中藥中劑量組與之差異無統(tǒng)計學意義;中藥各劑量組之間相比,中藥低劑量組血清LN、Col-Ⅳ含量高,中藥高劑量組含量最低,中藥中劑量組居中,中藥各劑量組間存在顯著性差異(P＜0.05)。此結果提示,化瘀通絡中藥可明顯降低肝纖維化大鼠血清LN、Col-Ⅳ含量,此可能為其治療肝纖維化的機制之一。
　　 5化瘀通絡中藥對肝纖

16、維化大鼠Ras/ERK信號轉導途徑的影響
　　 5.1各組大鼠肝臟組織PDGF mRNA含量、Ras蛋白mRNA水平
　　 各組大鼠肝組織PDGF mRNA、Ras mRNA含量的表達結果顯示:與正常組相比,其余各組PDGF mRNA、Ras mRNA含量均升高(P＜0.05),其中模型組含量最高,中藥低劑量組次之,西藥組、中藥中劑量組再次之,中藥高劑量組含量表達最低(P＜0.05);與模型組相比,余各組肝組織PDGFm

17、RNA、Ras mRNA含量的表達均較低(P＜0.05);與西藥組相比,中藥中劑量組與之差異無統(tǒng)計學意義;中藥各劑量組之間比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),其中,中藥低劑量組表達較高,中藥中劑量組次之,中藥高劑量組肝組織PDGF mRNA、Ras mRNA含量的表達最低。
　　 5.2各組大鼠肝組織ERK1含量表達
　　 正常組大鼠肝組織中ERK1呈棕黃色弱陽性表達,主要可見于小葉中央靜脈四周、匯管區(qū)及肝索Disse腔間

18、隙中,高倍鏡下觀察可見ERK1位于Disse間隙的肝星狀細胞胞質中,肝細胞中未見表達;模型組大鼠肝組織中ERK1表達明顯增多、增強,匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝小葉內(nèi)均可見大量星芒狀、條索狀ERK1陽性表達,高倍鏡下觀察可見肝星狀細胞胞質、胞核為ERK1陽性表達的分布區(qū)域;其余西藥組、中藥各劑量組陽性染色程度較模型組明顯減輕,纖維隔內(nèi)間質細胞及炎細胞陽性染色程度減輕,ERK1陽性細胞數(shù)目減少,其中中藥高劑量組ERK1陽性程度最低,西藥組

19、、中藥中劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),中藥低劑量組ERK1陽性程度較中藥高、中劑量組稍高,但較模型組較低(P＜0.05)。
　　 提示,化瘀通絡中藥可明顯降低肝組織中PDGF mRNA的含量并減少Ras蛋白mRNA的表達,明顯減少大鼠肝組織ERK1的表達,顯著改善大鼠抗肝纖維化能力,此可能為其治療肝纖維化的機制之一。
　　 結論:
　　 1化瘀通絡中藥可改善肝纖維化大鼠的一般狀況,改善肝功能。

20、>　　 2化瘀通絡中藥可明顯改善肝纖維化大鼠肝臟纖維化程度,對于肝纖維化有良好的治療作用。
　　 3化瘀通絡中藥可明顯降低肝纖維化大鼠血清LN、Col-Ⅳ水平,減少二者在肝Disse間隙沉積,從而減少ECM蓄積,此可能為其治療肝纖維化的機制之一。
　　 4化瘀通絡中藥可明顯下調(diào)肝纖維化大鼠肝臟組織中PDGF mRNA、Ras蛋白mRNA以及ERK1的表達,提示其抗肝纖維化作用可能是通過激活Ras/ERK1/2信號轉導通