扶正化瘀方對(duì)肝星形細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:我國(guó)是肝病大國(guó)，慢性乙型肝炎患者數(shù)量占全世界的三分之一，慢性乙肝所引起的肝硬化甚至肝癌嚴(yán)重威脅患者的健康。纖維化是慢性肝病一個(gè)共同的病理過(guò)程，具有可逆性，我們可以通過(guò)研究肝纖維化的發(fā)生機(jī)制，尋求有效的藥物阻止肝纖維化的進(jìn)展，從而減緩慢性肝病發(fā)展為肝硬化的進(jìn)程。
　　 肝纖維化的研究較多，普遍肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是肝纖維化的中心事件，活化后的HSC產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extr

2、acellular matrix，ECM)，而基質(zhì)金屬蛋白酶分泌不足及其抑制劑分泌過(guò)多，過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)沉積在肝臟而形成的一個(gè)病理過(guò)程。早期HSC的活化主要是由肝中kupffer細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等分泌各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子引起，后期的持續(xù)活化則主要是由活化的HSC自分泌各種生長(zhǎng)因子維持，活化后的HSC源源不斷地產(chǎn)生ECM，促進(jìn)纖維化的進(jìn)一步發(fā)展，其中重要的生長(zhǎng)因子有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth fa

3、ctor beta，TGF-β1)、血小板源性生長(zhǎng)因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)等。
　　 在肝纖維化中，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，SEC)的作用也受到越來(lái)越多的重視。SEC是肝竇壁的主要細(xì)胞成分，SEC是一種特殊的血管內(nèi)皮細(xì)胞，形

4、態(tài)與功能都與普通的血管內(nèi)皮細(xì)胞有較大的差別，首先SEC胞質(zhì)上有排列成篩狀的窗孔結(jié)構(gòu)，有利于肝細(xì)胞和血竇中各種成分進(jìn)行交換。其次肝竇是一種不連續(xù)的毛細(xì)血管，內(nèi)皮下沒(méi)有基底膜的存在，僅有少量纖維結(jié)締組織，SEC也不表達(dá)普通血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，它有自身獨(dú)特的標(biāo)志物如CD4和CD14等。肝纖維化時(shí)，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生毛細(xì)血管化，即失去窗孔結(jié)構(gòu)，并有內(nèi)皮下連續(xù)性基底膜的形成，此時(shí)表型也發(fā)生較大的改變，失去自身的標(biāo)志物并開(kāi)始表達(dá)普通血管內(nèi)皮的標(biāo)志物

5、，如第Ⅷ因子相關(guān)抗原(Von Willebrand factor，vWF)、CD31和CD34等。
　　 目前，肝纖維化沒(méi)有特效的治療藥物，我國(guó)中藥及其復(fù)方因副作用小、多途徑、多靶點(diǎn)作用等特點(diǎn)，在肝纖維化治療中取得了較好的效果。扶正化瘀方（又稱(chēng)319方）由丹參、蟲(chóng)草菌絲、桃仁、絞股藍(lán)、五味子、松花粉組成，針對(duì)肝纖維化“瘀血阻絡(luò)、正氣虛弱”的基本中醫(yī)病因研制而成，有研究表明其具有保護(hù)肝細(xì)胞、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制促肝纖維化細(xì)胞因子生成

6、、抑制肝星形細(xì)胞增殖活化和膠原生成等作用。本實(shí)驗(yàn)以肝星形細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn)，研究扶正化瘀方抗肝纖維化的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。IFN-γ和β-雌激素是研究較多的抗纖維化藥物，研究表明均具有良好的抗纖維化作用，本實(shí)驗(yàn)γ-干擾素和β-雌二醇作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。
　　 目的:探討扶正化瘀方對(duì)肝星形細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，從細(xì)胞水平證實(shí)扶正化瘀方的抗纖維化作用。
　　 方法:扶正化瘀方藥物粉末以0

7、.46g/10ml的容積配制成懸液，以0.46g/kg大鼠體重的劑量灌胃SD大鼠，采取二次重復(fù)給藥方式，即第一次灌胃2小時(shí)后再次灌胃，第二次灌胃后1小時(shí)心臟采血，并離心全血提取藥物血清，對(duì)照組是在相同條件下灌胃三蒸水并提取對(duì)照組血清，將兩組血清以10％的濃度分別配制成的扶正化瘀方藥物組培基（簡(jiǎn)稱(chēng)319組）和對(duì)照組培基。同時(shí)在對(duì)照組培基中分別加入γ-干擾素、β-雌二醇作為陽(yáng)性對(duì)照藥物培基，四組培基分別作用于HSC和SEC48小時(shí)，用下列方

8、法檢測(cè)藥物對(duì)兩種細(xì)胞的影響:1.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)HSC表達(dá)α-SMA、Desmin的情況;2.Western blot方法檢測(cè)HSC表達(dá)α-SMA、Desmin、TGF-β1、CTGF蛋白的情況;3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC的增殖活性;4.免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot方法共同檢測(cè)SEC vWF、CD31的表達(dá)情況;5.掃描電鏡觀察SEC表面窗孔結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果:1.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示319組HSC表達(dá)α-SM

9、A、Desmin均較對(duì)照組明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而319組、γ-干擾素組和β-雌二醇組組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);2.Western blot結(jié)果顯示319組HSCα-SMA、desmin、TGF-β1、CTGF蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而319組、γ-干擾素組和β-雌二醇組組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3.流式細(xì)胞術(shù)顯示319組HSC增殖活力較對(duì)照組

10、降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而319組、γ-干擾素組和β-雌二醇組組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);4.免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot結(jié)果顯示319組SEC vWF、CD31蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而319組、γ-干擾素組及β-雌二醇組組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);5.掃描電鏡顯示對(duì)照組SEC大部分窗孔處于閉塞甚至消失狀態(tài)，而經(jīng)扶正化瘀方治療后SEC表面窗孔的