實(shí)驗(yàn)室常用質(zhì)粒對宿主大腸桿菌MG1655全菌蛋白表達(dá)譜影響的研究.pdf

1、質(zhì)粒是一種共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA，廣泛存在于微生物中，是不同于基因組且獨(dú)立于基因組之外的DNA?？梢宰灾鲝?fù)制，其大小由幾kb到幾百kb不等。質(zhì)粒在基因工程中的用途廣泛，有著重要的作用。實(shí)驗(yàn)室常用的質(zhì)粒通常包含復(fù)制子，抗性基因，多克隆酶切位點(diǎn)等原件。復(fù)制子決定了質(zhì)粒在宿主菌中的拷貝數(shù)，抗性基因是一種篩選標(biāo)記，多克隆位點(diǎn)上含有多種核酸酶酶切位點(diǎn)，可以方便外源基因片段的插入，從而有利于外源基因的克隆及表達(dá)。但是，質(zhì)粒對宿主菌的蛋白表達(dá)譜會產(chǎn)生

2、何種影響，目前還不是很清楚。因此本實(shí)驗(yàn)就實(shí)驗(yàn)室中保存的常用質(zhì)粒為研究對象，以大腸桿菌為宿主細(xì)菌，探討哪些質(zhì)粒載體會對宿主菌產(chǎn)生哪些具有重要意義的影響。
　　由于大腸桿菌具有清楚的遺傳背景，生長周期短，生長速度快，安全性好，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，是工業(yè)生產(chǎn)和科研的常用宿主菌。隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展，測定大腸桿菌表達(dá)的全部蛋白質(zhì)成為了可能。因此本實(shí)驗(yàn)擬利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究實(shí)驗(yàn)室常見的質(zhì)粒載體對大腸桿菌全菌蛋白表達(dá)譜變化的影響。本實(shí)驗(yàn)所選用的

3、質(zhì)粒有自殺性質(zhì)粒pXL275，克隆載體pACYC184、pEASY-T3、pUC19、pAK，表達(dá)載體pPROEX HTB，結(jié)合輔助質(zhì)粒pRK2013等，所選用的宿主菌是MG1655，后者是經(jīng)典的大腸桿菌K-12系列菌株。自殺性質(zhì)粒、克隆質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)入大腸桿菌MG1655，而結(jié)合輔助質(zhì)粒pRK2013較大，不能通過普通的質(zhì)粒提取和電轉(zhuǎn)方式導(dǎo)入大腸桿菌，故借助誘動轉(zhuǎn)移的手段導(dǎo)入MG1655，目的菌株均通過相應(yīng)抗性篩選獲得。

4、>　　導(dǎo)入外界質(zhì)粒的大腸桿菌通過雙向電泳檢測發(fā)現(xiàn):pXL275、pUC19、pAK、pPROEX HTB、pRK2013、pACYC184均不會引起大腸桿菌全菌蛋白譜的顯著變化，而質(zhì)粒pEASY-T3則引起大腸桿菌表達(dá)譜明顯的變化。我們對具有顯著差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行了生物質(zhì)譜分析，共鑒定到了33個蛋白點(diǎn)。其中pEASY-T3對大腸桿菌的蛋白表達(dá)產(chǎn)生的影響有(1)蛋白表達(dá)量缺失:磷酸戊糖變位酶，基因名為deoB;谷氨酸脫羧酶A，基因名為gad

5、A;蘋果酸合酶A，基因名為aceB;γ-氨基丁醛脫氫酶，基因名為prr;二肽轉(zhuǎn)運(yùn)子，基因名為dppA;超滲透誘導(dǎo)周質(zhì)蛋白，基因名為osmY;通用應(yīng)激蛋白，基因名為uspG;壓力響應(yīng)蛋白，基因名為hdeA;酸抗性蛋白，基因名為hdeB;保守蛋白YgiW，基因名為ygiW。(2)蛋白表達(dá)量明顯下調(diào):異檸檬酸裂解酶，基因名為aceA;甘油激酶，基因名為glpK;塔格糖-1，6-二磷酸醛縮酶，基因名為gatZ;二氫硫辛酰轉(zhuǎn)琥珀酰酶，基因名為su

6、cB;乙醛脫氫酶B，基因名為aldB;烯?；?酰基載體蛋白還原酶，基因名為fabI;乙二醛酶，基因名為hchA;鐵結(jié)合和貯藏蛋白，基因名為dps。(3)蛋白表達(dá)量明顯上調(diào):β-半乳糖苷酶，基因名為lacZ（載體質(zhì)?；蚓幋a）、β-內(nèi)酰胺酶，基因名為ampC（質(zhì)粒載體編碼）。
　　根據(jù)pUC19和pEASY-T3質(zhì)粒圖譜的不同，我們克隆了f1片段，并與pUC19重組，構(gòu)建重組載體pUC19-f1，電轉(zhuǎn)至大腸桿菌構(gòu)建菌MG1655/p

7、UC19-f1。MG1655/pUC19-f1雙向電泳和MG1655/pUC19經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后雙向電泳顯示兩菌GadA的表達(dá)下調(diào)，提示LacZ和f1片段對GadA的表達(dá)有影響，然而具體機(jī)制還需要探索。
　　總結(jié):質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，質(zhì)粒pEASY-T3抑制了MG1655的10種基因的表達(dá)，造成了蛋白的缺失表達(dá)。8種蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，2種蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)。在pEASY-T3直接抑制的10種基因中，與酸抗性相關(guān)基因gadA是目前研