低頻低強(qiáng)度超聲介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌及恥垢分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、意義：超聲促進(jìn)基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染是一種新興的方法，超聲介導(dǎo)轉(zhuǎn)化具有生物損害小、操作方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)療生物學(xué)科方面?zhèn)涫荜P(guān)注。同時(shí)，超聲轉(zhuǎn)化可以在同一實(shí)驗(yàn)條件下完成大樣本的實(shí)驗(yàn)，在工業(yè)生產(chǎn)中也具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前，超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的研究主要集中在革蘭陰性桿菌，如大腸桿菌、具核梭桿菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌，且對(duì)轉(zhuǎn)化條件的研究多為單一指標(biāo)觀察。
　　本文選用基因轉(zhuǎn)化中最常用的革蘭氏陰性桿菌大腸桿菌 DH5α和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊的恥垢分

2、枝桿菌作為基因轉(zhuǎn)化的受體菌，通對(duì)超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化進(jìn)行多指標(biāo)對(duì)比研究，希望建立低頻低強(qiáng)度超聲（Low-frequency and Low-intensity Ultrasound,LFLIU）介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌便捷、高效、安全的方法。在未來(lái)的發(fā)展中，超聲促進(jìn)基因轉(zhuǎn)化可能是成為一種有前途的基因治療的輔助技術(shù)。
　　目的：探討不同劑量的LFLIU，以及LFLIU聯(lián)合微泡等，介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不同細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率的影響，以及在基因和蛋白水平觀

3、察LFLIU輻照后對(duì)目的基因ClpP2表達(dá)情況的影響。
　　方法：
　　1.LFLIU介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌的效果觀察：用42kHz超聲輻照大腸桿菌DH5α和質(zhì)粒 DNA混合液，實(shí)驗(yàn)條件分別為：
　?。?）以0.5mmol/L CaCl2溶液為超聲介質(zhì)，采用0.13W/cm2超聲分別連續(xù)超聲輻照0s、20s、40s、80s、160s、320s；
　?。?）分別以無(wú)菌生理鹽水（不含有Ca2+）、0.5mmol/L C

4、aCl2、1mmol/L CaCl2、5mmol/L CaCl2、10mmol/L CaCl2溶液為超聲介質(zhì)，采用0.51W/cm2超聲輻照連續(xù)輻照160s；（3）以0.5mmol/L CaCl2溶液為超聲介質(zhì)，連續(xù)超聲輻照160s，超聲輻照強(qiáng)度分別為0W/cm2、0.13W/cm2、0.35W/cm2、0.51W/cm2、0.72W/cm2。觀察指標(biāo)：（1）比較不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的影響；（2）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)不同聲強(qiáng)對(duì)質(zhì)粒構(gòu)

5、型的影響；（3）流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同聲強(qiáng)對(duì)大腸桿菌存活率的影響。
　　2.LFLIU聯(lián)合微泡促進(jìn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌的效果觀察：用40kHz、0.27W/cm2超聲輻照恥垢分枝桿菌和外源物質(zhì)混合液，Sonovue?微泡濃度分別為：0mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、3.75mg/ml，LFLIU聯(lián)合Sonovue?輻照的時(shí)間分別為：0min、3min、5min、10min、20min。實(shí)驗(yàn)后觀察：
　?。?）比

6、較不同條件下質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率；
　　（2）菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)不同條件對(duì)恥垢分枝桿菌存活率的影響；
　?。?）共聚焦顯微鏡觀察LFLIU輻照后轉(zhuǎn)入細(xì)菌的Dextran-FITC熒光情況；
　　（4）掃描電鏡觀察超聲輻照后恥垢分枝桿菌的顯微結(jié)構(gòu)；
　?。?）q-PCR與Western blot分析分別在基因水平和蛋白水平，鑒定LFLIU輻照后對(duì)目的基因ClpP2表達(dá)情況影響。
　　結(jié)果：
　　1.LFLIU能夠

7、介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α及恥垢分枝桿菌，并在抗性培養(yǎng)板上篩選出陽(yáng)性菌株，其質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率與超聲輻照強(qiáng)度、超聲輻照時(shí)間、CaCl2介質(zhì)的濃度有一定關(guān)系。
　　2.當(dāng)LFLIU聯(lián)合Sonovue?作用于恥垢分枝桿菌時(shí)，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率最高為19.33×102CFU/μgDNA，是單獨(dú)超聲作用下的19倍。
　　3.電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著超聲輻照劑量的增強(qiáng)對(duì)質(zhì)粒的構(gòu)型有一定影響，在聲強(qiáng)為0.72W/cm2對(duì)質(zhì)粒構(gòu)型的影響最為嚴(yán)重，

8、可見(jiàn)超螺旋質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變成開(kāi)環(huán)狀態(tài)，但不影響其結(jié)構(gòu)的完整性。
　　4.掃描電鏡觀察示單獨(dú)超聲輻照后細(xì)菌損傷較小，超聲聯(lián)合微泡后對(duì)超聲有一定損傷，造成細(xì)菌腫脹、細(xì)胞壁斷裂，菌體液化死亡等。
　　5.q-PCR結(jié)果顯示在LFLIU輻照10min后，可見(jiàn)ClpP2可以成功表達(dá)。Western blot分析結(jié)果顯示LFLIU輻照后的陽(yáng)性克隆可以成功表達(dá)目的基因ClpP2編碼的蛋白。
　　結(jié)論：LFLIU能夠介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌，LFL