水通道蛋白1、3在大鼠肺組織缺血再灌注損傷后的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:
　　 1.以大鼠肺組織為研究對(duì)象,建立一種簡單、可靠、重復(fù)性好的腫移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?模擬肺移植過程中肺組織熱缺血損傷以及缺血再灌注損傷過程。
　　 2.應(yīng)用免疫組化和分子生物學(xué)技術(shù),研究肺組織熱缺血損傷以及缺血再灌注損傷過程中水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白3(AQP3)的表達(dá)及其功能,以及藥物對(duì)其影響；探討其表達(dá)與肺移植后肺損傷的關(guān)系,進(jìn)一步闡明肺移植過程中肺熱缺血損傷以及缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制；為今后臨

2、床調(diào)控水通道治療肺移植后肺損傷提供科學(xué)的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.大鼠肺組織缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的建立以及肺組織水通道蛋白的檢測(cè)。
　　 將40只大鼠隨機(jī)分為供體組和受體組,每組20只。供體組再隨機(jī)分為2組,每組10只,分別為LPD灌注組與LPD+金納多組；受體組也隨機(jī)分為2組,每組10只。獲取供體組大鼠左肺為實(shí)驗(yàn)組,應(yīng)用受體組大鼠建立離體肺缺血再灌注模型。A組即LPD灌注組,供體大鼠左肺經(jīng)肺動(dòng)

3、脈灌注LPD液后于4℃保存8小時(shí),然后將受體鼠靜脈血經(jīng)左側(cè)股靜脈插管引出并灌注供體肺,供肺氧合后的動(dòng)脈血經(jīng)左側(cè)股動(dòng)脈回輸受體鼠.循環(huán)灌注1小時(shí),供體右肺為對(duì)照組,即B組；C組即LPD+金納多組,供體肺缺血前15分鐘經(jīng)靜脈給予金納多20mg/kg,余處理同LPD組,供體右肺為對(duì)照組,設(shè)為D組。造模成功后,取A、B、C、D四組肺組織；應(yīng)用免疫組化法、免疫印跡法、RT-PCR法檢測(cè)肺組織AQP1,AQP3蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　

4、2.大鼠肺組織熱缺血損傷動(dòng)物模型的建立以及肺組織水通道蛋白的檢測(cè)。
　　 將30只SD大鼠隨機(jī)分為A組:熱缺血時(shí)間0小時(shí)(n=10); B組:熱缺血時(shí)間1小時(shí)(n=10)；C組:熱缺血時(shí)間2小時(shí)(n=10).。大鼠用1％戊巴比妥鈉麻醉(30mg/kg),無需氣管插管。沿前正中線剪開胸骨及腹壁,離斷腹主動(dòng)脈放血至心跳停跳。處死后,A組:取左肺,立即用LPD液灌注；B組:室溫下放置60min,不進(jìn)行任何處理,再灌注肺保護(hù)液；C組:室

5、溫下放置120min,不進(jìn)行任何出理,再灌注肺保護(hù)液。造模成功后,切取部分肺組織,免疫組化法、免疫印跡法、RT-PCR法檢測(cè)肺組織AQP1,AQP3蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.建立離體大鼠肺組織缺血再灌注損傷動(dòng)物模型,進(jìn)行模擬肺移植后,灌注流量穩(wěn)定可調(diào),移植肺氣體交換好,能夠模擬肺移植的循環(huán)過程。
　　 2.離體肺缺血再灌注損傷后肺組織水通道蛋白的檢測(cè):
　　 AQP1表達(dá)在肺組織血管

6、內(nèi)皮細(xì)胞,AQP3表達(dá)在細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡Ⅱ型細(xì)胞和粘膜下腺分泌細(xì)胞。AQP1在A組,以及B組肺組織中的mRNA表達(dá)平均相對(duì)A值分別為0.30±0.08、0.63±0.10,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),AQP3分別為0.49±0.09、0.85±0.06,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AQP1在C組,以及D組肺組織中的mRNA表達(dá)平均相對(duì)A值分別為0.49±0.11、0.68±0.12,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),A

7、QP3分別為0.73±0.12、0.91±0.13,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):比較AQP1和AQP3在A組與C組肺組織中的mRNA表達(dá)平均相對(duì)A值差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 在A組以及B組肺組織中AQP1蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值分別為0.65±0.06、1.13±0.18,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AQP3蛋白分別為0.52±0.11、1.92±0.26,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在C組以及D

8、組肺組織中AQP1蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值分別為0.88±0.11、1.25±0.21,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),AQP3分別為0.96±0.18、1.89±0.32,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；比較AQP1和AQP3在A組與C組肺組織中蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.肺熱缺血損傷后肺組織水通道蛋白的檢測(cè):
　　 AQP1在熱缺血時(shí)間0小時(shí),1小時(shí)和2小時(shí)組的肺組織中的mR

9、NA表達(dá)平均相對(duì)A值分別為0.63±0.10、0.49±0.07、0.36±0.06,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),AQP3分別為0.85±0.06、0.76±0.08、0.52±0.07,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蛋白印跡分析結(jié)果顯示:B組C組肺組織AQP1和AQP3蛋白含量顯著下降,在熱缺血時(shí)間0小時(shí),1小時(shí)和2小時(shí)組的肺組織中AQP1蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值分別為1.13±0.18、0.88±0.13、0.76±0.09,

10、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AQP3蛋白分別為1.92±0.26、0.95±0.15、0.61±0.07,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.離體大鼠肺組織缺血再灌注損傷動(dòng)物模型以及肺組織熱缺血損傷動(dòng)物模型具有操作簡單、可靠、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),為研究肺移植過程中不同階段肺損傷的機(jī)制提供了良好的平臺(tái)。
　　 2.大鼠肺組織有AQP1及AQP3的表達(dá)。AQP1主要表達(dá)在肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞,AQ

11、P3表達(dá)在細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡Ⅱ型細(xì)胞和粘膜下腺分泌細(xì)胞。
　　 3.大鼠肺組織缺血再灌注損傷后,AQP1,AQP3表達(dá)下調(diào),提示缺血再灌注損傷可能與AQP1,AQP3表達(dá)下調(diào)有關(guān)；缺血前應(yīng)用金納多可使AQP1,AQP3表達(dá)下調(diào)程度減弱。提示金納多可能通過調(diào)控水通道表達(dá)水平減輕肺移植后缺血再灌注損傷。
　　 4.熱缺血損傷過程中,AQP1,AQP3表達(dá)明顯下調(diào),且熱缺血損傷時(shí)間不同,AQP1,AQP3表達(dá)下調(diào)程度有顯著