雙靶修飾策略同時實現(xiàn)阿霉素脂質(zhì)體腫瘤細胞高度識別與攝取.pdf

1、目的：構(gòu)建葉酸（Folate， FA）、TAT肽雙靶修飾阿霉素脂質(zhì)體（FA/TAT-LP-DOX），旨在實現(xiàn)FA主動靶向的同時，增強阿霉素脂質(zhì)體的細胞攝取，從而提高其抗腫瘤效果；同時研究雙靶脂質(zhì)體FA/TAT-LP-DOX的攝取途徑，闡明其發(fā)揮作用的機理。
　　方法：通過酰胺化反應(yīng)合成脂質(zhì)材料長鏈DSPE-PEG5000-FA，加成反應(yīng)合成短鏈DSPE-PEG2000-TAT，以薄層色譜（TLC）、紅外光譜（FTIR）、氫譜（1H

2、-NMR）、高效液相色譜（HPLC）等方法分別對合成產(chǎn)物進行表征。采用薄膜分散法及pH梯度法制備阿霉素脂質(zhì)體（LP-DOX），后插入法制備雙靶脂質(zhì)體。通過測定粒徑、Zeta電位、形態(tài)、包封率對脂質(zhì)體進行表征。體外評價中以過度表達葉酸受體的KB細胞作為細胞模型。采用 MTT法評價雙靶脂質(zhì)體的細胞毒性；通過熒光顯微鏡及流式細胞儀定性定量考察雙靶脂質(zhì)體的攝取效率；應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察雙靶脂質(zhì)體在細胞內(nèi)的分布情況；最后通過流式細胞儀及共聚焦

3、顯微鏡考察不同抑制劑的攝取抑制作用來闡明雙靶脂質(zhì)體的內(nèi)吞機制。
　　結(jié)果：脂質(zhì)材料DSPE-PEG5000-FA經(jīng)1H-NMR鑒定，其純度約為75%，DSPE-PEG2000-TAT經(jīng)HPLC計算，其TAT肽連接率約為95%。所制備雙靶脂質(zhì)體平均粒徑為142.1nm，包封率為92.2%，Zeta電位為4.4mV，證明TAT肽的正電荷被成功掩蔽。透射電鏡圖（TEM）顯示，雙靶阿霉素脂質(zhì)體分布均勻且呈球形。MTT實驗表明，配體FA、T

4、AT肽最佳密度分別為5%、2.5%，以此密度構(gòu)建最優(yōu)雙靶脂質(zhì)體FA/TAT-LP-DOX，與葉酸單靶脂質(zhì)體FA-LP-DOX相比，顯著（p<0.01）提高了細胞毒性。細胞攝取實驗證實，TAT肽與FA存在協(xié)同作用，雙靶脂質(zhì)體顯著地（p<0.01）提高了細胞攝取，其平均熒光強度為單靶葉酸脂質(zhì)體的1.7倍，攝取速率為單靶葉酸脂質(zhì)體的1.6倍。共聚焦顯微鏡及機制考察表明，雙靶脂質(zhì)體通過以網(wǎng)格蛋白為主的多種途徑進入KB細胞，遞送至溶酶體，并快速釋