黃芪甲苷對高糖所致人腎小球系膜細胞損傷的保護作用及其調(diào)控NADPH氧化酶-ROS-Akt-NF-κB信號通路的機制研究.pdf

1、糖尿病腎?。―iabetic nephropathy, DN）是糖尿?。―iabetes Mellitus, DM）最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病率隨著糖尿病病程的延長而升高。部分DN患者會進展為終末期腎?。‥nd-stage renal disease, ESRD），引起腎功能衰竭和腎移植，甚至導(dǎo)致患者死亡。
　　目前DN發(fā)病機制尚未被完全闡明，但其發(fā)病初期顯著的病理特征是腎小球系膜細胞（mesangial cells,

2、MCs）增生所致的腎小球肥大和MCs收縮功能障礙引起的腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）的升高。高糖狀態(tài)下機體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，活性氧（Reactive oxygen species, ROS）生成增多。NADPH氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH oxidase）是MCs中ROS的主要來源，Nox4是MCs中最重要的NA

3、DPH氧化酶亞基。NADPH氧化酶Nox4源性ROS參與了高糖誘導(dǎo)的MCs異常增殖。Akt/ NF-κB信號通路在高糖所致的MCs損傷中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，且與NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS生成密切相關(guān)。上述通路還參與了瞬時受體電位陽離子通道6（Canonical Transient Receptor Potential6, TRPC6）的調(diào)節(jié)，高糖環(huán)境下TRPC6蛋白表達下調(diào)介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流減少是MCs收縮功能受損的主要原因。雖然對

4、于DN的防治研究已不斷深入，但尋找安全有效的治療方法和藥物仍是當務(wù)之急。
　　黃芪為臨床常用中藥，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗缺血性腦損傷等多種藥理活性。黃芪甲苷（AstragalosidesⅣ，AS-Ⅳ）是從黃芪中提取的主要皂苷類活性成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ能有效減輕糖尿病大鼠的白蛋白尿，并能有效抑制其氧化應(yīng)激損傷。黃芪甲苷對于體外培養(yǎng)的系膜細胞的影響目前尚不十分明確。本研究旨在考察高糖誘導(dǎo)系膜細胞損傷的具體機制及其

5、黃芪甲苷的干預(yù)作用，以期為臨床治療糖尿病腎病提供有效的候選藥物和一定的實驗依據(jù)。
　　目的：
　　考察高糖對人腎小球系膜細胞增殖情況和TRPC6蛋白表達水平及鈣離子內(nèi)流的影響，并探討其對NADPH氧化酶/ ROS/ Akt/ NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用，考察黃芪甲苷對高糖所致人腎小球系膜細胞損傷的保護作用及其干預(yù)機制，為糖尿病腎病的理論研究和臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細

6、胞分為以下3組：（1）正常對照（NG:5.6 mM葡萄糖）組、（2）滲透壓對照（MA:NG+24.5 mM甘露醇）組、（3）高糖（HG:25 mM葡萄糖）組，采用MTT檢測各組細胞在孵育24 h、48 h、72 h、96 h后的增殖情況。
　　2.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG6 h組，（3）HG12 h組，（4）HG24 h組，（5）HG36 h組，（6）HG48 h組。采用實時熒光定量PCR

7、法檢測各組細胞Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表達水平，采用Western blot法檢測各組細胞的Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表達水平。
　　3.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下7組：（1）NG組，（2）HG0.5 h組，（3）HG1 h組，（4）HG3 h組，（5）HG12 h組，（6）HG24 h組，（7）HG48 h組。采用Western blot法檢測各組細胞的IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。
　　

8、4.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）NG組，（2）NG+Tempol100μM組，（3）NG+DPI10μM組，（4）HG組，（5）HG+Tempol100μM組，（6） HG+DPI10μM組，給藥48 h后，采用MTT法檢測各組細胞的增殖活力，采用 DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞 ROS水平，采用光度法檢測各組細胞NADPH氧化酶活性。
　　5.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）NG組，（2

9、）NG+FAMsiRNA組，（3）NG+Nox4 siRNA組，（4）HG組，（5）HG+FAM siRNA組，（6）HG+Nox4 siRNA組。刺激48 h后，采用MTT法檢測各組細胞的增殖活力，采用DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞ROS水平，采用光度法檢測各組細胞 NADPH氧化酶活性，采用 Western blot法檢測各組細胞 Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表達水平。
　　6.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組

10、：（1）NG組，（2）NG+FAMsiRNA組，（3）NG+IκBαsiRNA組，（4）HG組，（5）HG+FAM siRNA組，（6）HG+IκBαsiRNA組。刺激48 h后，采用MTT法檢測各組細胞增殖活力，采用DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞ROS水平，采用光度法檢測各組細胞NADPH氧化酶活性，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表達水平，采用 Western blot法檢測各組細

11、胞 Nox4蛋白、TRPC6蛋白的表達水平以及 Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。
　　7.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG組，（3）HG+LY29400210μM組，（4）HG+DPI10μM組，（5）HG+Tempol100μM組，（6）HG+Sul500μM組，給藥48 h后，采用MTT法檢測各組細胞的增殖活力，采用DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞ROS水平，采用光

12、度法檢測各組細胞 NADPH氧化酶活性，采用實時熒光定量 PCR法檢測各組細胞的Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表達水平，采用Western blot法檢測各組細胞的Nox4蛋白、TRPC6蛋白的表達水平以及 Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。采用Fluo-3/AM熒光探針法檢測各組細胞的游離鈣離子濃度。
　　8.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下9組：（1）NG組，（2）MA組，（3）HG組，（

13、4）HG+AS-Ⅳ5μM組，（5）HG+AS-Ⅳ10μM組，（6）HG+AS-Ⅳ25μM組，（7）HG+AS-Ⅳ50μM組，（8）HG+AS-Ⅳ100μM組，（9） HG+0.5％DMSO組。給藥48 h后，采用MTT法檢測各組細胞的增殖情況。
　　9.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下9組：（1）NG組，（2）MA組，（3）HG組，（4）HG+AS-Ⅳ5μM組，（5）HG+AS-Ⅳ10μM組，（6）HG+AS-Ⅳ25μM組，（

14、7）HG+AS-Ⅳ50μM組，（8）HG+AS-Ⅳ100μM組，（9）HG+0.5% DMSO組。給藥48 h后，通過計算細胞總蛋白/細胞數(shù)的比值考察各組細胞的肥大情況。
　　10.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下7組：（1）NG組，（2）NG+AS-Ⅳ5μM組，（3）NG+AS-Ⅳ10μM組，（4）NG+AS-Ⅳ25μM組，（5）NG+AS-Ⅳ50μM組，（6）NG+AS-Ⅳ100μM組，（7）NG+0.5%DMSO組。給藥

15、48 h后，采用MTT法檢測各組細胞的增殖活力，考察黃芪甲苷藥物本身有無細胞毒性。
　　11.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG組，（3）HG+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+Tempol100μM組，給藥48 h后，采用DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞ROS水平。
　　12.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）

16、NG組，（2）HG組，（3）HG+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+OAG100μM組，給藥48 h后，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞的TRPC6 mRNA的表達水平，采用Western blot法檢測各組細胞的TRPC6蛋白的表達水平，采用Fluo-3/AM熒光探針法檢測各組細胞的游離鈣離子濃度。
　　13.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）NG

17、組，（2）HG組，（3）HG+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+DPI10μM組，給藥48 h后，采用光度法檢測各組細胞NADPH氧化酶活性，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞的Nox4 mRNA的表達水平，采用Western blot法檢測各組細胞的Nox4蛋白的表達水平。
　　14.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG組，（3）HG

18、+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+LY2940010μM組，給藥48 h后，采用Western blot法檢測各組細胞Akt蛋白的磷酸化水平。
　　15.將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞分為以下6組：（1）NG組，（2）HG組，（3）HG+AS-Ⅳ25μM組，（4）HG+AS-Ⅳ50μM組，（5）HG+AS-Ⅳ100μM組，（6）HG+Sul500μM組，給藥48h后，

19、采用Western blot法檢測各組細胞的IκBα蛋白的磷酸化和降解水平。
　　結(jié)果：
　　1.高糖培養(yǎng)一定時間后人腎小球系膜細胞的增殖活力顯著升高，細胞明顯肥大。但給予甘露醇的系膜細胞活力沒有明顯變化，表明高糖的上述作用并非由于其高滲透壓所致。高糖還能明顯增強人腎小球系膜細胞中NADPH氧化酶的活性，促進ROS的生成。高糖對系膜細胞增殖的促進作用能夠被NADPH氧化酶抑制劑和ROS抑制劑有效抑制。
　　2.高糖培養(yǎng)

20、一定時間后人腎小球系膜細胞中NADPH氧化酶亞基Nox4 mRNA及蛋白表達水平顯著上調(diào)。采用RNAi技術(shù)特異性沉默Nox4基因后，高糖環(huán)境下人腎小球系膜細胞內(nèi)NADPH氧化酶的活性和ROS的生成均顯著降低，且細胞增殖也受明顯抑制，提示高糖促系膜細胞增殖作用可能是通過上調(diào) Nox4亞基的表達，從而促進NADPH氧化酶活化和ROS生成來實現(xiàn)的。
　　3.高糖培養(yǎng)一定時間后人腎小球系膜細胞中Akt蛋白的磷酸化水平、IκBα蛋白的磷酸化

21、和降解水平顯著上調(diào)，激活A(yù)kt/NF-κB信號通路。NADPH氧化酶抑制劑和ROS抑制劑均能顯著抑制高糖環(huán)境下人腎小球系膜細胞中Akt和NF-κB的活化，提示高糖對人腎小球系膜細胞中Akt/ NF-κB信號通路的調(diào)控作用與NADPH氧化酶性ROS具有緊密的相關(guān)性。Akt抑制劑能顯著抑制高糖環(huán)境下人腎小球系膜細胞中Nox4蛋白的表達水平并抑制NADPH氧化酶性ROS的生成，還能有效抑制IκBα蛋白的磷酸化和降解，以及細胞增殖水平，而IκB

22、α表達被抑制時對高糖環(huán)境下MCs中Akt蛋白的磷酸化水平、Nox4蛋白表達水平、NADPH氧化酶活性以及ROS水平均沒有明顯影響，僅抑制細胞異常增殖。提示在上述信號通路中Akt活化與NADPH氧化酶性ROS生成可能是相互平行或相互交叉影響，并共同參與促進NF-κB的活化。
　　4.高糖培養(yǎng)一定時間后人腎小球系膜細胞中TRPC6 mRNA和蛋白表達水平顯著下調(diào)，鈣離子內(nèi)流顯著減少。當Nox4或IκBα表達被抑制時，高糖下調(diào)的TRPC

23、6蛋白表達水平顯著升高；此外當采用NADPH氧化酶抑制劑、ROS抑制劑、Akt抑制劑以及 IκBα抑制劑時均能顯著增強高糖環(huán)境下人腎小球系膜細胞中TRPC6蛋白的表達，并促進鈣離子內(nèi)流，提示高糖可能是通過激活NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信號通路來發(fā)揮對人腎小球系膜細胞中TRPC6蛋白表達和鈣離子內(nèi)流的抑制作用，從而導(dǎo)致系膜細胞收縮功能障礙。
　　5.黃芪甲苷能濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細胞異常增殖和細胞

24、肥大，以及TRPC6蛋白表達下調(diào)和鈣離子內(nèi)流減少。
　　6.黃芪甲苷能濃度依賴性地抑制高糖環(huán)境下人腎小球系膜細胞中的ROS生成、NADPH氧化酶活化、Nox4亞基的表達、Akt蛋白磷酸化以及 IκBα蛋白磷酸化和降解，從而發(fā)揮對系膜細胞中高糖活化的NADPH氧化酶/ ROS/ Akt/NF-κB信號通路的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.高糖能誘導(dǎo)人腎小球系膜細胞的異常增殖和肥大，并顯著抑制系膜細胞TRPC6蛋白的表達和

25、鈣離子內(nèi)流，從而損傷系膜細胞活力和收縮功能。高糖誘導(dǎo)系膜細胞損傷的作用可能是通過調(diào)節(jié)NADPH氧化酶/ROS/Akt/NF-κB信號通路來實現(xiàn)的，在該信號通路中，NADPH氧化酶性ROS生成與Akt信號活化可能是相互平行或相互交叉作用，并共同存在于NF-κB信號的上游。
　　2.黃芪甲苷對高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細胞異常增殖和肥大以及 TRPC6蛋白下調(diào)和鈣離子內(nèi)流減少具有有效的抑制作用，從而保護高糖環(huán)境下系膜細胞的活力和收縮功能。