兔脂肪干細(xì)胞BrdU標(biāo)記情況的初步研究.pdf

1、目的：研究5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)的效果，確定體外標(biāo)記的最佳濃度和時(shí)間，評價(jià)BrdU標(biāo)記的ADSCs的適用性。 方法：取6月齡新西蘭白兔頸后皮下脂肪，采用I型膠原酶消化方法體外分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，利用成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向向成脂、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)并用組織化學(xué)方法鑒定其誘導(dǎo)結(jié)果，從而鑒定其具有多向分化的干細(xì)胞潛能。選取第3代ADSCs，分別采用5、10、15、20μmol/L濃度的BrdU體

2、外標(biāo)記干細(xì)胞24、48、72小時(shí)，利用免疫組化實(shí)驗(yàn)計(jì)算不同濃度和標(biāo)記時(shí)間下脂肪干細(xì)胞的標(biāo)記率，確定BrdU對ADSCs的最佳標(biāo)記方法。通過臺盼藍(lán)染色和細(xì)胞倍增時(shí)間的測量確定最佳標(biāo)記方法的安全性。對第3代脂肪干細(xì)胞采用最佳標(biāo)記方法標(biāo)記后更換為普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，適時(shí)傳代，連續(xù)檢測第5、7、9、11代脂肪干細(xì)胞的Brdu標(biāo)記率，了解該標(biāo)記方法在脂肪干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)過程中的衰減情況。同時(shí)將標(biāo)記后的第3代脂肪干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，未標(biāo)記細(xì)胞作為對

3、照組，分別種植于乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)支架材料上，體外培養(yǎng)3天后自體回植于動物皮下，4周后取出支架材料，制作石蠟切片采用免疫組化法鑒定BrdU標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)標(biāo)記的效果。 結(jié)果：兔脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)具有成纖維細(xì)胞樣外形，增埴迅速，連續(xù)傳代14代細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，無自發(fā)性向脂肪細(xì)胞分化現(xiàn)象。成脂誘導(dǎo)12天后油紅O染色胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅染的油滴，成骨誘導(dǎo)14天后Von kossa染色陽性，由此證明在體外定向誘導(dǎo)后脂肪干

4、細(xì)胞可以向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化。BrdU可標(biāo)記脂肪干細(xì)胞的核，采用10μmol/L的BrdU體外標(biāo)記48小時(shí)是適宜的標(biāo)記方法，該方法對脂肪干細(xì)胞的增殖無明顯影響。初測標(biāo)記率達(dá)95％，標(biāo)記率隨傳代次數(shù)而降低，傳代8次(約體外培養(yǎng)4周)后標(biāo)記率仍達(dá)41％。同期進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BrdU標(biāo)記后的脂肪干細(xì)胞移植入體內(nèi)4周后免疫組化檢測有BrdU陽性細(xì)胞存在，從而證明移植的脂肪干細(xì)胞可以在體內(nèi)存活。 結(jié)論：兔脂肪干細(xì)胞易于體外分離培