人脂肪干細(xì)胞行Edu標(biāo)記效果的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 人脂肪干細(xì)胞(ADSC，Adipose-derivedstemcells)是從脂肪組織中分離出來(lái)的，并能顯示出持續(xù)的細(xì)胞增殖能力及向小同組織細(xì)胞定向分化的能力的細(xì)胞，具有組織量多，來(lái)源廣泛的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及臨床細(xì)胞治療中，且具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。自體脂肪移植在整形外科中廣泛應(yīng)用，但成活率低，需重復(fù)治療等缺點(diǎn)是整形外科醫(yī)生面臨的重大問(wèn)題。為了解決這一問(wèn)題，需要對(duì)脂肪成活機(jī)制準(zhǔn)確把握。在脂肪成活

2、過(guò)程中，ADSC的作用尤為明顯。一些理論推斷脂肪干細(xì)胞的作用通過(guò)脂肪干細(xì)胞的增炳、分化成新的脂肪組織并提供適應(yīng)的環(huán)境來(lái)促進(jìn)脂肪的成活，但未有定論，且需要更多、更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)來(lái)回答這一問(wèn)題。我們的實(shí)驗(yàn)選用一種新的示蹤劑，通過(guò)細(xì)胞示蹤米探究脂肪干細(xì)胞在脂肪移植中的作用機(jī)制。Edu是一種核酸類似物，在細(xì)胞分裂增殖的過(guò)程中參與到核染色體中達(dá)到標(biāo)記目的。
　　 目的：
　　 觀察體外培養(yǎng)時(shí)不同培養(yǎng)階段的人脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)

3、特點(diǎn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步確立最佳的標(biāo)記濃度及標(biāo)記時(shí)間組合。進(jìn)一步通過(guò)與未標(biāo)記的干細(xì)胞的進(jìn)行增殖及分化影響的比較以選出最適標(biāo)記濃度及時(shí)間。
　　 方法：
　　 1、人ADSC的體外培養(yǎng)分離、培養(yǎng)和鑒定。經(jīng)知情同意后，取吸脂手術(shù)來(lái)源的脂肪顆粒，使用酶消化法獲得SVF細(xì)胞，原代培養(yǎng)在7-10天時(shí)達(dá)80％-90%的細(xì)胞融合，干細(xì)胞進(jìn)一步傳代培養(yǎng)進(jìn)行純化和擴(kuò)增。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。細(xì)胞傳至第3代后，分別用于鑒定細(xì)胞及用于細(xì)胞標(biāo)

4、記的研究。
　　 2、Edu在不同濃度及時(shí)間標(biāo)記的組合下進(jìn)行研究。分別采5uM，10uM，20uM,50uM的濃度及12小時(shí)，24小時(shí)進(jìn)行標(biāo)記，Edu標(biāo)記后的細(xì)胞去除含Edu的培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液并固定細(xì)胞，以Alexa-555染色后行流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)標(biāo)記率，從而挑選出各時(shí)間點(diǎn)中較適宜的標(biāo)記組合。
　　 3、測(cè)定Edu在較適宜的標(biāo)記率情況下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的影響，以未標(biāo)記細(xì)胞作為空白對(duì)照。Edu對(duì)干細(xì)胞細(xì)胞活性及增殖

5、的影響以臺(tái)盼藍(lán)排斥反應(yīng)及MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　 4、測(cè)定Edu標(biāo)記后影響細(xì)胞分化的能力。即去除Edu后，脂肪干細(xì)胞行定向成脂及成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)束后行油紅O染色及茜素紅染色鑒定分化結(jié)果。數(shù)據(jù)以SPSS13.0進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 原代細(xì)胞貼壁后呈一定方向的成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)。在第5到第7天時(shí)細(xì)胞克隆逐漸變大并相互融合并形成單層。7-10天時(shí)將細(xì)胞消化下來(lái)并進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，2-3天即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿

6、的底部并進(jìn)一步傳代。3代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型時(shí)表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志如CD90，CD105，CD44，而且不表達(dá)或弱表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)志CD34，CD45。
　　 Edu的標(biāo)記是在細(xì)胞分裂增殖時(shí)，新合成的細(xì)胞才能被標(biāo)記上。流式結(jié)果表明，分別在10uM，12h和5uM，24h標(biāo)記時(shí)，細(xì)胞標(biāo)記率可達(dá)約90%。更高的濃度并不能明顯提高細(xì)胞的標(biāo)記率，且會(huì)對(duì)細(xì)胞活性有影響。因此，選定此兩組作為實(shí)驗(yàn)組，未標(biāo)記細(xì)胞作為對(duì)照組，分析標(biāo)記后對(duì)細(xì)胞增

7、殖分化的影響。
　　 標(biāo)記后的細(xì)胞即可被消化，制成單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示細(xì)胞死亡比例各組問(wèn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MTT實(shí)驗(yàn)分析，三組間10uM，12h與對(duì)照組曲線較相近，但略低,5uM，24h與對(duì)照組曲線較遠(yuǎn)，證實(shí)標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞增殖有一定的影響，以10uM，12h組標(biāo)記者影響較小。
　　 標(biāo)記后的細(xì)胞去除Edu后定向分化，成脂誘導(dǎo)2周，成骨誘導(dǎo)3周。分別以油紅O染色及茜素紅染色，隨機(jī)每高倍鏡視野下計(jì)數(shù)成脂細(xì)胞數(shù)及鈣結(jié)節(jié)