脂肪干細(xì)胞治療小鼠卵巢早衰的初步研究.pdf

1、研究背景:卵巢早衰近年來發(fā)病率日益增高,與腫瘤患者治療方案(化療、放療)的不斷完善密不可分,有效的治療使得患者的長期生存率顯著提高。尤其是年輕的生育期腫瘤患者,由于放化療破壞了大多數(shù)的分裂細(xì)胞,化療后她們都可能會(huì)面臨閉經(jīng)、不孕不育以及卵巢早衰的問題。
　　目前臨床主要以雌孕激素替代療法和輔助生殖技術(shù)來治療卵巢早衰,免疫抑制治療主要用于免疫因素引起的卵巢早衰。但目前這些治療方法尚不能從根本上修復(fù)受損的卵巢功能,且長期應(yīng)用還可能會(huì)引起

2、一些副作用。所以,怎樣提前預(yù)防和恢復(fù)衰退的卵巢功能,尋求新的治療方法,從而恢復(fù)患者的生育功能是科研工作者面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。
　　隨著對(duì)干細(xì)胞認(rèn)識(shí)的不斷深入,其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的巨大潛力被逐漸發(fā)掘出來。已有研究發(fā)現(xiàn),骨髓干細(xì)胞,臍帶干細(xì)胞等可以減少卵巢結(jié)構(gòu)及功能損傷,而脂肪干細(xì)胞對(duì)卵巢早衰的治療作用尚不清楚。脂肪干細(xì)胞具有較低的免疫原性,來源豐富,獲取方便,生長迅速,可以作為自體移植的來源。許多研究報(bào)道,脂肪干細(xì)胞移植可以改善損傷組織的結(jié)構(gòu)

3、和功能。本研究通過探討脂肪干細(xì)胞治療化療性及自身免疫性卵巢早衰及其機(jī)制,以期為卵巢早衰的治療提供一種新的思路和方法。
　　第一部分:脂肪干細(xì)胞對(duì)小鼠化療性卵巢早衰治療作用的初步研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　建立小鼠化療性卵巢早衰模型,分離小鼠脂肪干細(xì)胞并探討其對(duì)化療性卵巢早衰的治療作用。
　　研究方法:
　　1.應(yīng)用酶消化法分離小鼠脂肪干細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)脂肪干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行鑒定,并通過誘導(dǎo)成骨、成脂來

4、鑒定干細(xì)胞多向分化的潛能。
　　2.采用腹腔注射化療藥物環(huán)磷酰胺的方法來建立小鼠卵巢早衰模型。并采用卵巢原位注射法及尾靜脈注射法進(jìn)行移植。
　　3.分別于干細(xì)胞移植后1周、1月處死各實(shí)驗(yàn)組小鼠,并取小鼠卵巢,通過HE染色法觀察各組卵巢卵泡形態(tài)及數(shù)目變化。
　　4.比較各組小鼠排卵數(shù)目和質(zhì)量的變化。
　　5.Tunel染色觀察小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.經(jīng)體外培養(yǎng)及鑒定我們獲得

5、了性質(zhì)穩(wěn)定的脂肪干細(xì)胞。
　　2.早衰組卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量明顯減少;干細(xì)胞移植后各級(jí)卵泡數(shù)目明顯增多,治療后一周,原始卵泡和竇狀卵泡數(shù)目明顯升高,治療一月后,成熟卵泡數(shù)目也明顯升高。
　　3.與早衰組相比,移植組在移植一周及一月時(shí)小鼠排卵數(shù)目顯著增高。
　　4.移植后一周后小鼠卵巢中凋亡的顆粒細(xì)胞明顯減少。
　　結(jié)論:
　　脂肪干細(xì)胞對(duì)化療性卵巢早衰有一定的治療作用,在臨床應(yīng)用方面具有潛在價(jià)值。
　　第二

6、部分:脂肪干細(xì)胞治療化療性卵巢早衰分子機(jī)制的初步研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　探討脂肪干細(xì)胞治療化療性卵巢早衰的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.用綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞移植治療卵巢早衰,追蹤其歸巢及定位情況。
　　2.通過基因芯片來研究脂肪干細(xì)胞移植對(duì)小鼠化療性卵巢早衰基因表達(dá)譜的影響。從而了解脂肪干細(xì)胞治療卵巢早衰的內(nèi)在機(jī)

7、制。
　　3.采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)以鑒定隨機(jī)選取的差異表達(dá)基因。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.移植后一周和一月均能在卵巢中追蹤到脂肪干細(xì)胞。
　　2.基因芯片結(jié)果顯示,與早衰組相比,治療后尾靜脈組有176個(gè)基因發(fā)生變化,原位注射組有225個(gè)基因發(fā)生變化,許多基因在卵泡發(fā)育及卵子形成中起重要作用。

8、r>　　3.qRT-PCR隨機(jī)挑選的差異基因表達(dá)變化與相應(yīng)的基因芯片結(jié)果相一致。
　　結(jié)論:
　　脂肪干細(xì)胞對(duì)能通過調(diào)控某些基因來改善小鼠卵巢功能。脂肪干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)修復(fù)卵巢功能也起到重要的作用。
　　第三部分:脂肪干細(xì)胞對(duì)小鼠免疫性卵巢早衰治療作用的初步研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　建立小鼠卵巢早衰的免疫模型,移植ADSCs后觀察脂肪干細(xì)胞對(duì)小鼠自身免疫性卵巢早衰的初步治療作用。
　　研究方法:

9、
　　1.依據(jù)小鼠透明帶3(zonapellucida3,ZP3)的第330-342個(gè)氨基酸序列合成ZP3多肽,通過小鼠雙后掌皮下多點(diǎn)注射ZP3來建立卵巢早衰免疫模型。
　　2.干細(xì)胞治療組于免疫后14天原位注射脂肪干細(xì)胞。于干細(xì)胞移植后1周處死各實(shí)驗(yàn)組小鼠,觀察小鼠動(dòng)情周期及卵巢組織學(xué)變化,并比較各組小鼠卵巢抗透明帶抗體陽性率。
　　3.比較各組小鼠排卵數(shù)目和質(zhì)量的變化。
　　4.用CM-Dil標(biāo)記脂肪干細(xì)胞,

10、追蹤脂肪干細(xì)胞歸巢情況。
　　5.觀察各組小鼠顆粒細(xì)胞凋亡情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.皮下注射ZP3后,免疫模型組卵巢組織學(xué)表現(xiàn)以大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤為特征的自身免疫性卵巢炎。移植后小鼠自身免疫性卵巢炎明顯好轉(zhuǎn),抗透明帶抗體陽性率降低。
　　2.移植后排卵率顯著增高。
　　3.移植一周及兩周后可在卵巢追蹤到CM-Dil陽性細(xì)胞。
　　4.移植一周后顆粒細(xì)胞凋亡減少。
　　結(jié)論