鴨疫里默氏桿菌1型磷酸二酯酶基因的發(fā)現(xiàn)及其克隆表達(dá)和應(yīng)用研究.pdf

1、血清1型鴨疫里默氏桿菌CH-1株表達(dá)型DNA文庫的免疫篩選以兔抗鴨疫里默氏桿菌陽性血清對RA血清1型CH-1株表達(dá)型DNA文庫中已通過藍(lán)白斑篩選的一個(gè)陽性克隆進(jìn)行原位雜交篩選。經(jīng)過5次免疫篩選后，陽性斑經(jīng)過體內(nèi)刪除、噬菌粒經(jīng)酶切分析和序列測定，得到一段4434bp的插入DNA片段，并將序列遞交GenBank，獲得登錄號為EF030421。 鴨疫里默氏桿菌1型磷酸二酯酶基因的發(fā)現(xiàn)及其生物信息學(xué)分析運(yùn)用NCBI的BLASTN、BLA

2、STP、ORFFinder、ConservedDomains、EMBL的FASTA等程序?qū)ζ渲幸粋€(gè)命名為ORF1689的開放閱讀框架進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示ORF1689起始密碼子上游存在核糖體結(jié)合位點(diǎn)，完整ORF含1689bp，編碼562個(gè)氨基酸(aa)，其編碼蛋白的理論分子量為59.5kD，等電點(diǎn)為5.82。ORF1689具有phosphodiest蛋白家族的保守區(qū)域，與丙桿菌屬的Caulobactersp.K31、鞘氨

3、醇單胞菌(Sphingomonassp.)、Sphingopyxisalaskensis和Novosphingobiumaromaticivorans的1型磷酸二酯酶基因的氨基酸序列同源性分別為49.283％、38.716％、38.693％和38.313％，表明該基因是一種新的1型磷酸二酯酶基因。 鴨疫里默氏桿菌1型磷酸二酯酶基因的原核表達(dá)及表達(dá)重組蛋白的高免血清的制備根據(jù)所提交的序列的PDE1基因段設(shè)計(jì)一對引物，從血清1型鴨疫

4、里默氏桿菌CH-1株中擴(kuò)增出PDE1基因并將其克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)PCR、酶切和DNA測序鑒定之后，將PDE1基因正向插入原核表達(dá)載體pET-32a(+)的BamHⅠ和HindⅢ位點(diǎn)間，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-PDE1。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-PDE1轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出大小約為80KD的PDE1重組蛋白。對重組蛋白進(jìn)行了可溶性與不可溶性分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶性包

5、涵體的形式存在。同時(shí)對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳表達(dá)條件。 采用鎳金屬螯合介質(zhì)填料(Ni-NTASuperflow)對重組蛋白進(jìn)行親和層析純化，得到高純度的重組蛋白。以兔抗RA陽性血清進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果表明該重組表達(dá)蛋白具有較好的免疫原性。以純化的重組蛋白為抗原免疫家兔制備多克隆血清，并對血清進(jìn)行了純化和ELISA效價(jià)檢測，為進(jìn)一步研究該基因提供關(guān)鍵技術(shù)材料。 基于PDE1重組蛋白檢測RA

6、感染的ELISA方法的建立與應(yīng)用以PDE1重組蛋白為包被抗原(重組蛋白量為5ug/mL)建立了檢測RA感染的ELISA方法。結(jié)果表明當(dāng)OD450＞0.271時(shí)即判定為陽性，當(dāng)OD450≤0.271時(shí)即判定為陰性。且該方法可以特異性地區(qū)別臨床上鴨瘟病毒病、鴨乙肝病毒病、鴨病毒性肝炎病、鴨大腸桿菌病和鴨沙門氏菌病。表明該法可以作為鴨疫里默氏桿菌感染的臨床診斷和檢測。 基于兔抗重組1型磷酸二酯酶蛋白抗體的免疫組化方法和免疫熒光方法檢測

7、RA建立和比較利用純化的兔抗PDE1重組蛋白IgG抗體建立了檢測鴨疫里默氏桿菌的間接免疫組化方法和間接免疫熒光方法。兩種方法對鴨瘟、鴨源禽流感、鴨病毒性肝炎、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌、鴨多殺性巴氏桿菌感染發(fā)病和死亡雛鴨組織進(jìn)行檢測，不出現(xiàn)陽性反應(yīng)，而檢測RA人工感染發(fā)病死亡雛鴨，可在心肌、肝臟、脾臟、肺臟、胰臟、腎臟、法氏囊、哈德氏腺、胸腺、腦、十二指腸、直腸、盲腸中檢測到RA抗原，RA抗原主要分布于細(xì)胞漿、組織間隙和血液中。通過試驗(yàn)比較

8、，間接免疫組化和間接免疫熒光檢測RA抗原定位的結(jié)果基本一致，也與我實(shí)驗(yàn)室劉維平建立的利用抗RA全血清的間接免疫組化法檢測出的規(guī)律相一致。證明了1型磷酸二酯酶基因是RA的一個(gè)標(biāo)志性基因。 鴨疫里默氏桿菌1型磷酸二酯酶重組蛋白的免疫原性研究分別采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)?zāi)旯ザ颈Ｗo(hù)實(shí)驗(yàn)對PDE1重組蛋白進(jìn)行免疫原性研究。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備純化的兔抗PDE1重組蛋白抗體與PDE1重組蛋白能特異性地結(jié)合。 將PDE1重組蛋白與等量的