PRMT2基因的miRNA載體構(gòu)建及其活性鑒定.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建人蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2（protein arginine methyltransferase2, PRMT2）基因的miRNA真核表達(dá)載體，利用microRNA靶向PRMT2基因，鑒定其轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF7后的生物活性。
　　方法：
　　根據(jù) PRMT2基因序列設(shè)計合成4對pre-miRNA片段，定向克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達(dá)載體上，采用菌落PCR和測序分析鑒定

2、插入序列的完整性；并將重組載體轉(zhuǎn)染至MCF7細(xì)胞株中，采用Western blot方法鑒定重組載體轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后對PRMT2蛋白表達(dá)的干擾效果，以及螢火蟲熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)檢測PRMT2及其重組體對ERα轉(zhuǎn)錄活性影響。
　　結(jié)果：
　　1．構(gòu)建的重組體插入片段的堿基序列完全正確，間接免疫熒光法和western blot法檢測表明：重組體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后可成功干擾PRMT2基因的表達(dá)。
　　2．重組體轉(zhuǎn)染組

3、 miPRMT2-1，miPRMT2-2，miPRMT2-3，miPRMT2-4四個重組體轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)水平中，miPRMT2-3重組轉(zhuǎn)染體蛋白表達(dá)減低最明顯。
　　3.與未轉(zhuǎn)染組及control-miRNA組相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miPRMT2的MCF7細(xì)胞對雌激素的敏感性明顯下降。
　　4. PRMT2及其重組體對ERE-LUC轉(zhuǎn)錄活性的抑制是雌激素依賴的。在無E2刺激的條件下，PRMT2及其重組體對ERE-LUC轉(zhuǎn)錄活性無明