Pdx1、Ngn3和MafA共轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為胰島素分泌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的
　　糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的最主要疾病之一，全球糖尿病患者已超過2億人，并將于2025年達(dá)到4億人。目前治療1型糖尿病主要依賴于注射胰島素，這卻并不能阻止慢性血管病變的發(fā)展，且有發(fā)生低血糖等并發(fā)癥的危險(xiǎn)。2000年埃德蒙頓方案實(shí)施以來，胰島移植被認(rèn)為是治療1型及部分重癥2型糖尿病的理想方法。但是，胰島移植臨床應(yīng)用也受到許多因素限制，其中最主要障礙是人供胰嚴(yán)重短缺。尋找可替代胰島β細(xì)胞并且能夠提供胰島素分泌功

2、能的移植供體，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
　　而細(xì)胞核重編程技術(shù)的出現(xiàn)，為尋找替代胰島β細(xì)胞的研究提供新的希望。細(xì)胞核重編程指的是細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)由一種類型變成另一種類型。通過這一技術(shù)，可以在同一個(gè)體上將較容易獲得的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)變成另一種較難獲得的細(xì)胞類型。在這個(gè)領(lǐng)域的一個(gè)新的進(jìn)展就是將胰腺的外分泌細(xì)胞直接轉(zhuǎn)變成內(nèi)分泌細(xì)胞。在這個(gè)研究當(dāng)中，用腺病毒轉(zhuǎn)入三個(gè)通常為胰島β細(xì)胞分化所需的轉(zhuǎn)錄因子胰腺-十二指腸同源框1(pancreaticduod

3、enalhomeobox1，Pdx1)、神經(jīng)元素3（neurogenin3，Ngn3）和肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(v-mafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomologueA，MafA)后，就成功轉(zhuǎn)染的胰腺外分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。Slack等構(gòu)建了一個(gè)腺病毒載體Ad-PNM，同時(shí)包含小鼠Pdx1、Ngn3和MafA基因的編碼序列在同一的轉(zhuǎn)錄單元，這樣既可以保證實(shí)驗(yàn)細(xì)胞同時(shí)接受

4、上述的三個(gè)基因，同時(shí)也可以簡(jiǎn)化操作步驟。應(yīng)用此載體，Slack等人成功的將大鼠胰腺外分泌細(xì)胞系A(chǔ)R42j-B13轉(zhuǎn)化為胰島素分泌細(xì)胞。
　　在個(gè)體發(fā)育過程中，肝臟和胰腺都起源于前腸末端，發(fā)育上的同源性提示肝臟和胰腺在細(xì)胞增殖和分化調(diào)控等方面有很高的相似性，這就為肝臟來源的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島β細(xì)胞提供可能性。目前已有證據(jù)表明，有些胰腺發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可將肝原始細(xì)胞、成熟的肝細(xì)胞，甚至肝腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化為可分泌胰島素的胰島細(xì)胞樣細(xì)胞。

5、考慮到肝細(xì)胞的易獲得性，肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化胰島素分泌細(xì)胞的研究將會(huì)為臨床應(yīng)用帶來更好的前景。
　　同時(shí)肝細(xì)胞是人體重要的一類細(xì)胞，主要能夠合成白蛋白等血漿蛋白、參與膽汁合成、脂類代謝、糖代謝以及蛋白加工等。另外，肝特異性的轉(zhuǎn)錄因子還參與到胰島素合成和分泌過程。因而，研究在轉(zhuǎn)分化的胰島素分泌細(xì)胞內(nèi)這些肝特異性基因和肝特異性轉(zhuǎn)錄因子是如何變化，既可進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)分化的詳細(xì)機(jī)制，又可以明確與胰島素合成和分泌相關(guān)的基因的改變情況，為進(jìn)一步完善改造胰

6、島素分泌細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)
　　方法
　　(1)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將包含有Pdx1、Ngn3和MafA編碼區(qū)域的Ad-PNM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞BRL3A，并低糖培養(yǎng)基中使其轉(zhuǎn)分化成為胰島素分泌細(xì)胞。以Ad-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染前，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞第1、3、5和7天形態(tài)變化;采用生長(zhǎng)曲線法觀察增殖能力變化情況。采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胰島素分泌細(xì)胞內(nèi)外源性小鼠Pdx1、Ngn3和Maf

7、A，大鼠Pdx1、Ngn3和MafA，大鼠Ins1和Ins2基因的表達(dá)。采用Real-TimePCR法定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后第1、3、5和7天的細(xì)胞內(nèi)Insulin的相對(duì)表達(dá)量。采用免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染后第1、3、5和7天的細(xì)胞內(nèi)Pdx1、Ngn3、MafA和insulin蛋白的定位。采用Elisa法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后第1、3、5和7天的細(xì)胞內(nèi)的胰島素含量以及分泌量。(2)采用免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胰島素分泌細(xì)胞內(nèi)albumin和insulin

8、蛋白的定位。分別采用Real-TimePCR和WesternBlot定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胰島素分泌細(xì)胞內(nèi)肝特異性基因(Alb、Glul和Factor(Ⅹ))和肝特異性轉(zhuǎn)錄因子（HNF1α、HNF3α、HNF6、LRH-1和C/EBP-β）的表達(dá)改變情況。
　　結(jié)果
　　(1)轉(zhuǎn)染包含有Pdx1、Ngn3和MafA編碼區(qū)域的Ad-PNM質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染后6hr即可觀察到細(xì)胞由正常狀態(tài)下的橢圓形變成扁平的類似于成纖維細(xì)胞的形狀。整細(xì)胞體積變

9、小，細(xì)胞漿變少，細(xì)胞核變小且不清晰。1d后這種轉(zhuǎn)變有所改善，部分細(xì)胞體積較6hr時(shí)明顯增大，細(xì)胞核清晰。而到3d時(shí)，大部分細(xì)胞重新變回或接近橢圓形，僅有少部分細(xì)胞仍為類似于成纖維細(xì)胞的形態(tài)。轉(zhuǎn)染后胰島素分泌細(xì)胞增殖能力明顯低于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)顯示轉(zhuǎn)染后24hr有95.13±1.05％細(xì)胞的表達(dá)Pdx1蛋白熒光信號(hào)，說明轉(zhuǎn)染效率良好。轉(zhuǎn)染后24hr即可檢測(cè)到外源性小鼠來源Pdx1，Ngn3和MafA基因的mRNA水

10、平表達(dá)，而內(nèi)源性大鼠Pdx1基因的mRNA始終沒有檢測(cè)到。在轉(zhuǎn)染后3d，可以檢測(cè)到大鼠胰島素基因Ins1和Ins2的mRNA表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后第3天，可以觀測(cè)到胰島素分泌細(xì)胞內(nèi)的insulin在mRNA水平表達(dá)。Elisa法轉(zhuǎn)染前細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測(cè)不到胰島素，而轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到胰島素，并在轉(zhuǎn)染后第5天達(dá)到最高值，與細(xì)胞內(nèi)總蛋白相比為81.97±3.10pg/μg。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞沒有胰島素分泌能力，無論是在高糖或是低糖條件下。而轉(zhuǎn)染后細(xì)胞可以檢

11、測(cè)到分泌到培養(yǎng)液中胰島素，但在不同葡萄糖濃度條件下檢測(cè)到的胰島素含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明轉(zhuǎn)染后得到的胰島素分泌細(xì)胞并沒有根據(jù)葡萄糖濃度調(diào)節(jié)胰島素分泌的功能。(2)部分轉(zhuǎn)染后胰島素分泌細(xì)胞可于胞漿中檢測(cè)出Insulin的表達(dá)，而相對(duì)應(yīng)的這些細(xì)胞內(nèi)Albumin的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)或者消失。轉(zhuǎn)染后第5天Alb、Glul和FactorⅩ基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)對(duì)比未轉(zhuǎn)染前的表達(dá)水平有不同程度的下降(P＜0.05)。與肝臟特異性基因表達(dá)均下調(diào)不

12、同，肝臟特異性轉(zhuǎn)錄因子HNF1α、HNF3α和HNF6在轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)錄因子Lrh1和C/EBP-β的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　(1)Pdx1、Ngn3和MafA成功的將大鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島素分泌細(xì)胞。(2)轉(zhuǎn)分化后的胰島素分泌細(xì)胞能分泌一定量的胰島素，但并不能夠根據(jù)葡萄糖濃度進(jìn)行而調(diào)節(jié)胰島素分泌量。(3)轉(zhuǎn)分化的胰島素分泌細(xì)胞內(nèi)肝特異性基因和轉(zhuǎn)錄因子存在明顯改變，其中Al