大鼠腸粘蛋白rMuc3 SEA組件內(nèi)N-糖苷型糖鏈在其翻譯后修飾中的作用的研究.pdf

1、目的: 探討大鼠粘蛋白rMuc3 SEA組件內(nèi)7個(gè)N-糖苷型糖鏈對(duì)LSKGSIVV基序酶切的影響、及其在酶切后氨基端和羧基端兩個(gè)裂解片段連接和rMuc3羧基端細(xì)胞膜定位中的作用。 方法: 以p20為模板(含Muc3羧基端cDNA的真核表達(dá)載體)，采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除糖基化位點(diǎn)后得到各種單陰性突變體和多重陰性突變體，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。收集各陰性突變體及p20用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過(guò)Western blottin

2、g利用抗V5抗體或抗Myc抗體鑒定細(xì)胞裂解產(chǎn)物，使用NBT/BCIP底物檢測(cè)陽(yáng)性條帶。用FITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗觀察胞漿和胞膜上的熒光分布，以評(píng)價(jià)其在細(xì)胞內(nèi)的膜定位情況。 結(jié)果： 1、使用PCR定點(diǎn)突變的方法，獲得各陰性突變體，經(jīng)序列測(cè)定后利用clustalx1.83軟件與相應(yīng)模板比對(duì)，證實(shí)突變完全成功。并通過(guò)質(zhì)粒中量提取獲得了足量的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。 2、收集細(xì)胞溶解產(chǎn)物用抗V5抗體在p20和N4A，N5A，N6

3、A和N7A檢測(cè)到氨基端分子量為26-30 kDa.的產(chǎn)物，主要位于30 kDa，30 kDa以下代表不完全酶切部分。而N1A，N2A或N3A氨基端分子量基本為26 kDa或26 kDa以下不完全酶切的部分。抗myc抗體檢測(cè)NIA，N2A，N3A和p20的C端片段的分子量主要是49kDa，在47kDa處有一條由于不完全糖基化的較淺的條帶。N4A、N5A、N6A和N7A酶切后C端的分子量主要是45kDa和46kDa，低于野生型p20 C端酶

4、切片段的分子量(49 kDa)。 3、N34A、N345A、N3457A和N34567A的N端酶切片段的分子量和單突變體N3A相似，均大約是26kDa。六重突變體N134567A和N234567A的N端酶切片段的分子量相同，均降為了23kDa。在N34A、N345A、N3457A、N34567A、N234567A和N134567A，表達(dá)產(chǎn)物的C端酶切片段的分子量逐漸降低，而七重突變體N1234567A的C端片段則消失了。

5、 4、去除了所有7個(gè)N型糖基化位點(diǎn)的N1234567A轉(zhuǎn)染后的產(chǎn)物100％未被酶切，可以同時(shí)被抗V5抗體和抗myc抗體識(shí)別。六重突變體N134567A和N234567A分別有85.03％和72.89％未酶切產(chǎn)物。只含有兩個(gè)N-糖苷型糖鏈的N34567A有48.34％的未酶切產(chǎn)物。而含有三個(gè)N-糖苷型糖鏈的N3457A則只有1.99％的未酶切部分。N34A和N345A的結(jié)果與p20的結(jié)果相似，幾乎完全酶切。 5、各種N糖苷型糖鏈陰

6、性突變體和野生型p20的培養(yǎng)上清中通過(guò)免疫反應(yīng)沒(méi)有檢測(cè)出相應(yīng)的N端片段。 6、免疫熒光實(shí)驗(yàn)中看到N2A、N234567A和N1234567A在細(xì)胞固定和不固定情況下細(xì)胞膜上均未出現(xiàn)熒光，其余各種N糖苷型糖鏈陰性突變體在固定和不固定兩種情況下的熒光分布與野生型p20相似。 結(jié)論：以p20為模板的各種突變體突變成功，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所有突變體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞并獲得了相應(yīng)突變體的高效表達(dá)。通過(guò)Western blotting