腸道粘蛋白型O-型糖鏈調(diào)節(jié)病原體與腸上皮細(xì)胞間作用的研究.pdf

1、目的與背景:
　　腸道粘液屏障是人體胃腸道與外部環(huán)境直接接觸的重要防御屏障,粘蛋白是其重要組成部分。粘蛋白是高分子量且高度糖基化的糖蛋白,其主鏈結(jié)構(gòu)是富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的O-型糖鏈,粘蛋白功能的發(fā)揮與O-型糖鏈的存在密切相關(guān),該類分子蛋白質(zhì)翻譯后的O-型糖基化在調(diào)節(jié)真核生物的復(fù)雜性功能中起著重要作用。不同的碳水化合物殘基添加到N-乙?；咸烟巧?賦予了粘蛋白型O-型糖鏈各種不同的主鏈結(jié)構(gòu),主要分為Core1,Core2,C

2、ore3和Core4型O-型糖鏈結(jié)構(gòu)。研究指出,某些O-glycans可以作為細(xì)菌表面的粘附素(adhesin)連接細(xì)胞表面碳水化合物的配體,粘蛋白O-glycans的末端唾液酸加帽所組成的ABH及其Lewis表位是幽門螺桿菌和致病性大腸桿菌表面粘附素的連接受體。然而,O-型糖鏈與病原微生物之間的相互作用機(jī)理目前尚不清楚。所以,我們選取編碼Core2 O-型糖鏈的C2GnT-2和編碼Core3型O-型糖鏈的Core3合酶(β3GnT6)

3、來探討其參與大腸桿菌對腸上皮細(xì)胞的粘附與侵襲的影響。通過該研究揭示不同類型的O-型糖基化參與腸粘液屏障功能形成的分子機(jī)制,有助于我們理解腸道感染的發(fā)生并為增強(qiáng)腸粘液屏障功能的研究提供一個(gè)新的選擇。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、shRNA-Ctr/HT-29及shRNA-C2GnT-2/HT-29穩(wěn)定細(xì)胞系,將它們與腸致病性大腸桿菌(enteropathogenic E.coli EPEC)和腸出血性大腸桿

4、菌(EHEC O157:H7)共同培養(yǎng),通過系列稀釋克隆計(jì)數(shù)法分別計(jì)數(shù)粘附于shRNA-C2 GnT-2/HT-29細(xì)胞表面以及侵襲入shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞內(nèi)的大腸桿菌的克隆數(shù)。并將粘附的大腸桿菌EPEC和EHEC O157:H7用碘化丙啶染色、透化及固定,進(jìn)一步用結(jié)合有FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色腸道上皮細(xì)胞的胞漿膜,通過熒光顯微鏡于鏡下計(jì)數(shù)出粘附于細(xì)胞的碘化丙啶染色的細(xì)菌數(shù)。
　　2.免疫組化、RT-PCR及

5、WB檢測正常人結(jié)腸組織、結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29,LS174T,Caco2)中β3GnT6編碼的Core3合酶的表達(dá)。
　　3.編碼Core3合酶的β3GnT6全長cDNA插入到真核表達(dá)載體上。從人正常結(jié)腸遠(yuǎn)端粘膜組織中提取RNA,行 RT-PCR擴(kuò)增β3GnT6全長片段,將 PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt載體上,將目的片段進(jìn)行測序比對,然后將β3GnT6連接到真核表達(dá)載體pEGFP-N1上,再次測序插入片段。

6、
　　結(jié)果:
　　1.通過細(xì)菌粘附和侵襲實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果:相較于對照細(xì)胞,EPEC或EHEC O157:H7粘附于shRNA-C2GnT-2/HT-29細(xì)胞表面的數(shù)量明顯減少,侵襲入shRNA-C2 GnT-2/HT-29細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量明顯增加。
　　2.免疫組化、RT-PCR、WB證實(shí)編碼β3GnT6的Core3合酶高豐度表達(dá)于正常的結(jié)腸粘膜組織,但在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29、LS174T、Caco2)幾乎不表