細(xì)胞程序性壞死在宿主防御病原體中的作用和調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和意義:
　　病原體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是哺乳動(dòng)物防御系統(tǒng)的一個(gè)至關(guān)重要的部分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RIP3依賴的細(xì)胞程序性壞死參與到了機(jī)體防御外來(lái)入侵病原體的過(guò)程中，但病原體激活RIP3依賴的細(xì)胞程序性壞死的具體分子機(jī)制尚不清楚。
　　研究目的:
　　探究HSV-1誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死的分子機(jī)制，以及這種程序性壞死方式如何在機(jī)體抗病毒中發(fā)揮作用。
　　研究方法:
　　為了篩選能夠引發(fā)RIP3-依賴性細(xì)胞壞死的病毒，我

2、們利用兩株牛痘病毒和兩株HSV-1感染W(wǎng)T和RIP3缺失的MEF細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的存活率；為了檢測(cè)了RIP3的缺失是否影響了病毒的入侵和復(fù)制，用HSV-1感染了野生型和RIP3缺失的MEF細(xì)胞，之后通過(guò)蛋白免疫印跡和熒光定量PCR檢測(cè)病毒蛋白和基因的表達(dá)水平。為了檢測(cè)RIP3缺失對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，利用蛋白免疫印跡檢測(cè)MEF細(xì)胞和RIP3缺失的MEF細(xì)胞感染HSV-1后p-IκBα水平；為了檢測(cè)TNFR,TLR3，Nectin-1

3、，MLKL，CYLD和 DAI是否參與到這條信號(hào)通路，通過(guò)對(duì)TNFR1KO,TNFR1/2 DKO,TLR3 KO細(xì)胞感染HSV-1檢測(cè)存活率，通過(guò)RNAi沉默Nectin-1，CYLD后感染HSV-1檢測(cè)存活率，通過(guò)構(gòu)建MLKL shRNA細(xì)胞系和通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建DAI KO細(xì)胞系，感染HSV-1后檢測(cè)存活率；在RIP3缺失的MEF細(xì)胞上構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)HA和Flag標(biāo)簽的RIP3的細(xì)胞系，對(duì)細(xì)胞感染病毒后，利用RIP

4、3的免疫共沉淀，將產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析去尋找參與激活HSV-1誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的關(guān)鍵作用蛋白；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒體系使ICP6在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)以檢測(cè)ICP6蛋白的表達(dá)是否足以激活RIP3/MLK依賴的細(xì)胞壞死；對(duì)野生型小鼠和和RIP3 KO小鼠腹腔注射HSV-1，檢測(cè)小鼠腦，脾，肝，血清中的病毒滴度，對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行切片及免疫組化，對(duì)小鼠注射一次或兩次病毒后，監(jiān)控存活率，以此確定RIP3在小鼠抵御病毒復(fù)制和致病中的作用。
　　研究結(jié)果:

5、　?。?）HSV-1的感染激活RIP3-依賴性細(xì)胞壞死；
　?。?）細(xì)胞凋亡不參與到HSV-1激活的細(xì)胞死亡:
　?。?）RIP3的缺失不影響HSV-1入侵細(xì)胞以及病毒自身的復(fù)制:
　?。?）RIP3的缺失不影響HSV-1激活的NF-κB信號(hào)活性:
　?。?）HSV-1感染誘發(fā)的細(xì)胞程序性壞死不依賴TNFR，CYLD，TLR3，但依賴于Nectin-1:
　　（6）HSV-1感染誘發(fā)的細(xì)胞程序性壞死不依賴于

6、DAI:
　?。?）MLKL是HSV-1感染誘發(fā)的細(xì)胞程序性壞死依賴于RIP3的底物MLKL:
　?。?）病毒蛋白ICP6參與到HSV-1激活的RIP3免疫復(fù)合體中；
　　（9）ICP6與RIP3通過(guò)RIP同源作用域(RHIM)相互作用；
　?。?0）ICP6對(duì)于HSV-1誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死是必須的；
　?。?1）ICP6的表達(dá)足以激活RIP3/MLKL介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死；
　?。?2）ICP6激

7、活的細(xì)胞程序性壞死依賴于ICP6和RIP3的RHIM結(jié)構(gòu)域及RIP3的激酶活性；
　?。?3）RIP3介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死幫助機(jī)體抵御HSV-1；
　?。?4）RIP3介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死幫助宿主抵抗HSV-1的復(fù)制和造成的致死。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，我們的工作首次發(fā)現(xiàn)了RIP3識(shí)別HSV-1病毒ICP6進(jìn)而啟動(dòng)宿主細(xì)胞程序性壞死的分子機(jī)制，并揭示了RIP3-依賴性細(xì)胞壞死在機(jī)體抗HSV-1病毒感染中的重要