活性氧介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在博萊霉素誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及皮膚組織纖維化中的作用研究.pdf

1、研究背景：硬皮病(Scleroderma)是一種以皮膚、血管和內(nèi)臟器官發(fā)生廣泛纖維化，同時針對自身抗原產(chǎn)生一系列自身抗體為特征的全身性結(jié)締組織病。雖然目前仍對其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但過量的ECM成分（尤其是膠原成分）在皮膚、內(nèi)臟及血管周圍沉積導(dǎo)致組織器官纖維化是該病的重要特征之一。一般認(rèn)為在纖維化組織器官中膠原合成增加和降解減少導(dǎo)致機(jī)體正常的平衡遭到破壞可能是造成膠原過量沉積的重要原因之一。當(dāng)機(jī)體組織受到內(nèi)外源性因子作用后，成纖維細(xì)胞

2、等將轉(zhuǎn)化成具有收縮和強(qiáng)分泌功能的肌成纖維細(xì)胞，從而大量分泌膠原來修復(fù)組織損傷，當(dāng)肌成纖維細(xì)胞分泌的ECM過量時，導(dǎo)致ECM在組織細(xì)胞間過量沉積，將會使組織器官發(fā)生纖維化，從而導(dǎo)致相應(yīng)組織器官出現(xiàn)嚴(yán)重的功能障礙。近年來越來越多的臨床研究和動物實驗證據(jù)表明上皮細(xì)胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞增加在組織纖維化中的發(fā)揮重要的作用。然而，啟動上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過

3、程需要細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)因子刺激，從而啟動相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。近年來，越來越多的研究也顯示活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能也參與調(diào)控上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過程。然而目前對于皮膚組織纖維化中是否發(fā)生EMT及其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。
　　研究目的：本研究通過對經(jīng)皮下注射博萊霉素誘導(dǎo)BALB/c小鼠皮膚組織纖維化的硬皮病動物模型進(jìn)行研究，探討：⑴博萊霉素能否通過誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞增加參與皮膚組織發(fā)生纖維化；⑵

4、活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否在博萊霉素經(jīng)皮注射誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT與組織纖維化中可能發(fā)揮一定的作用；⑶活性氧是否參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而通過未折疊蛋白反應(yīng)引發(fā)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT及其分子機(jī)制。
　　研究方法：
　?、艦樘接懖┤R霉素染毒后皮膚組織是否發(fā)生纖維化，通過取染毒部位皮膚組織，將組織處理后經(jīng)H&E染色和天狼星紅染色用于病理學(xué)觀察皮膚厚度及膠原纖維含量變化，并且將新鮮的皮膚組織經(jīng)堿裂解法裂解后用于羥脯氨酸含量檢測來反

5、映皮膚組織纖維化程度；
　　⑵為探討皮膚纖維化組織中上皮細(xì)胞是否發(fā)生EMT現(xiàn)象，通過病理學(xué)觀察皮膚上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；并且將新鮮皮膚制備冰凍切片，利用免疫熒光檢測上皮細(xì)胞特征蛋白 E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞特征蛋白Vimentin在皮膚表皮層上皮細(xì)胞中的表達(dá)；同時將新鮮皮膚組織制備勻漿后，利用蛋白質(zhì)免疫印跡和RT-PCR檢測E-cadherin和Vimentin蛋白及基因在皮膚組織中的表達(dá)；
　?、菫樘接懫つw纖維化組織

6、中活性氧是否引起氧化應(yīng)激，利用MDA含量反映脂質(zhì)過氧化程度，利用羰基化合物的含量反映蛋白質(zhì)的氧化損傷程度。同時利用黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)測量SOD酶活力，利用過氧化氫與鉬酸銨反應(yīng)系統(tǒng)測量CAT酶活力，利用GPX催化GSH的反應(yīng)速度來表示GPX活性，通過檢測GSR催化NADPH的改變來反映GSR活力，來反映多種抗氧化酶活性變化；
　?、葹樘接懫つw纖維化組織中細(xì)胞是否發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及未折疊蛋白反應(yīng)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

7、激特征性蛋白Bip及活化的未折疊反應(yīng)蛋白pIRE1α在皮膚組織中的表達(dá)；并且利用透射電子顯微鏡觀察基底層上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)變化，探討皮膚表皮層中基底膜帶附近上皮細(xì)胞是否發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；
　?、蔀樘接憙?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT中的分子機(jī)制，采用化學(xué)伴侶PBA來干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡定量檢測活化狀態(tài)pSmad2/3和pSrc蛋白在皮膚組織中的表達(dá)情況，探討Smad和Src激酶信號通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)

8、上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT過程中作用；
　?、蕿樘接懟钚匝跏欠袷遣┤R霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT和組織纖維化的上游信號，采用抗氧化劑NAC來干預(yù)活性氧介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測Bip蛋白和pIRE1α在干預(yù)后皮膚組織中的表達(dá)水平，利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測 E-cadherin和Vimentin在干預(yù)后的皮膚組織中的表達(dá)，同時利用H&E染色和天狼星紅染色用于病理學(xué)觀察來反映干預(yù)后皮膚厚度及膠原纖維含量變化。

9、r>　　實驗結(jié)果：⑴博萊霉素經(jīng)皮注射染毒后導(dǎo)致染毒部位皮膚彈性明顯下降，皮膚出現(xiàn)變硬，皮層厚度增加，并且染毒部位皮膚毛發(fā)生長緩慢或難以再生，同時博萊霉素組小鼠體重隨著染毒時間延長呈明顯下降趨勢。取染毒部位皮膚采用H&E染色和天狼星紅染色后病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，隨著染毒時間的延長皮膚組織表皮和真皮層厚度及膠原纖維含量明顯增加，并且觀察到炎性細(xì)胞在真皮層中浸潤的數(shù)量也明顯增加，皮膚厚度隨染毒時間呈明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系，同時皮膚厚度和膠原纖維含

10、量在染毒2 wks就開始與對照組之間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。皮膚組織中羥脯氨酸含量檢測結(jié)果也顯示，博萊霉素染毒4 wks后的皮膚組織中羥脯氨酸含量較PBS處理組明顯增加，以上結(jié)果表明博萊霉素染毒后皮膚組織中發(fā)生了明顯纖維化；
　?、仆ㄟ^ H&E染色后病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，博萊霉素染毒組皮膚表皮層中臨近基底膜上皮細(xì)胞和毛囊周圍上皮細(xì)胞脫離基底膜的數(shù)量明顯增加，并且染毒3wks組導(dǎo)致臨近基底膜上皮細(xì)胞脫離基底膜的上皮細(xì)胞數(shù)量增加最為明顯，而

11、染毒4wks組的皮膚組織中，表皮層中臨近基底膜上皮細(xì)胞脫離基底膜的數(shù)量較多；免疫熒光檢測結(jié)果顯示博萊霉素處理組皮膚組織中臨近基底膜上皮細(xì)胞和毛囊周圍上皮細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)較對照組也明顯增強(qiáng)；進(jìn)一步利用蛋白質(zhì)免疫印跡和RT-PCR檢測E-cadherin和Vimentin蛋白及基因在博萊霉素經(jīng)皮注射皮膚組織中的表達(dá)，實驗結(jié)果顯示，隨著染毒時間的延長皮膚組織中E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)，而Vimentin表達(dá)明顯上調(diào)，E-

12、cadherin蛋白表達(dá)在染毒2 wks，而Vimentin蛋白表達(dá)在染毒3 wks時開始與PBS對照組之間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，以上結(jié)果表明博萊霉素誘導(dǎo)皮膚纖維化組織中上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT現(xiàn)象；
　　⑶通過對活性氧介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)損傷及抗氧化酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，博萊霉素處理組皮膚組織勻漿中MDA和蛋白質(zhì)羰基含量較PBS處理組明顯增加，抗氧化劑NAC能明顯抑制MDA和蛋白質(zhì)羰基含量增加，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗分析，兩者之間差別都具有統(tǒng)計學(xué)

13、意義；對抗氧化酶活性檢測發(fā)現(xiàn)博萊霉素處理組皮膚組織勻漿中SOD酶活力較PBS處理組明顯增加，博萊霉素處理組CAT和GPX酶活力較PBS處理組變化不明顯，但博萊霉素處理組GSR酶活力較PBS處理組明顯下降，以上結(jié)果表明博萊霉素能明顯誘導(dǎo)皮膚組織發(fā)生氧化應(yīng)激；
　?、韧ㄟ^蛋白質(zhì)免疫印跡檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特征性蛋白 Bip在皮膚組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，博萊霉素染毒組皮膚組織中Bip表達(dá)水平從2W開始較PBS對照組明顯增加，呈現(xiàn)時間-效應(yīng)關(guān)系，并且

14、經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗分析，實驗組較對照組差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義。透射電子顯微鏡觀察基底層上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)變化，觀察結(jié)果顯示基底層上皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)在博萊霉素染毒2wks即出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張，在博萊霉素染毒3wks時擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯增多?；瘜W(xué)分子伴侶 PBA能抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白 Bip和未折疊反應(yīng)蛋白pIRE1α表達(dá)，并且PBA干預(yù)后能夠能夠抑制博萊霉素致皮膚組織中E-cadherin表達(dá)下調(diào)和Vimentin表達(dá)水平增高，以上結(jié)果表明博

15、萊霉素能夠誘導(dǎo)皮膚組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與調(diào)控上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT過程；
　?、赏ㄟ^蛋白質(zhì)免疫印跡檢測pSmad2/3和pSrc蛋白質(zhì)在博萊霉素經(jīng)皮注射3wks后的皮膚組織中的表達(dá)情況及PBA的干預(yù)作用，結(jié)果顯示博萊霉素能明顯誘導(dǎo)pSmad2/3和pSrc蛋白質(zhì)在皮膚組織中的表達(dá)，并且PBA能明顯抑制博萊霉素誘導(dǎo)pSmad2/3和pSrc蛋白質(zhì)在皮膚組織中的表達(dá)，以上結(jié)果提示Smad2/3和Src介導(dǎo)的信號通路可能參

16、與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT；
　?、世每寡趸瘎㎞AC來干預(yù)活性氧介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，結(jié)果顯示NAC能夠抑制Bip和pIRE1α在皮膚組織中的表達(dá)水平，抑制博萊霉素誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)下調(diào)和Vimentin表達(dá)上調(diào)，同時抑制皮膚組織纖維化，以上結(jié)果表明活性氧可能作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT和組織纖維化的上游信號分子。
　　實驗結(jié)論：在博萊霉素經(jīng)皮注射誘導(dǎo)皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT及組織纖維化中，大量

17、氧自由基可能通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)中IRE1蛋白激活，IRE1可通過使Smad2/3激酶發(fā)生磷酸化從而激活其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin表達(dá)；或者可能通過激活Src激酶，繼而激活其信號通路使E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間連接發(fā)生重構(gòu)，或通過胞吞進(jìn)入胞漿使其降解，最終使皮膚組織上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。皮膚上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后進(jìn)一步增加了皮膚組織中肌成纖