甘草甜素對腎小球硬化早期防護作用的實驗研究.pdf

1、目的：兒童腎病綜合征(NS)發(fā)病機制仍未闡明，此病預后導致腎小球硬化以致腎功能衰竭。腎小球硬化以腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質(ECM)大量積聚為特征。TGFβ1、CTGF和MMPs/TIMPs等參與腎小球疾病的演變過程，促進ECM積聚，造成腎小球硬化。因此，阻斷參與腎小球硬化的細胞因子和ECM的積聚是防止腎小球硬化進展的關鍵。采用免疫學和分子生物學方法，以阿霉素大鼠腎小球硬化模型為研究對象，觀察甘草甜素對TGFβ1、CTGF及TIMP

2、1的作用及其分泌ECM的影響；同時觀察甘草甜素對腎小球硬化模型形態(tài)學和超微結構及血液生化變化的影響，提供甘草甜素對腎小球硬化早期防護作用的實驗依據(jù)。 細胞外基質(ECM)成分包括：層粘連蛋白(LN)、纖維連接蛋白(FN)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)。相關細胞因子如：轉化生長因子β1(TGFβ1)、結締組織生長因子(CTGF)和金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)。 方法：采用阿霉素(ADR)兩次注射法，建立大鼠腎小球硬化的

3、模型。實驗分為三組，(1)對照組；(2)模型組；(3)治療組。模型組和治療組分別于第二次注射ADR后和第一次注射ADR后每天一次甘草甜素灌胃，并于第二次注射ADR后，同時觀察2、4、6和8周各項指標的變化。包括①24h尿蛋白定量，收集血液標本檢測血漿白蛋白(Alb)、膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)。②各組大鼠取腎皮質進行光鏡(HE、PAS、Masson染色)及電鏡等組織病理學檢測。③免疫組織化學方法檢測腎皮質部LN、F

4、N、ColⅣ、TGFβ1、CTGF和TIMP-1蛋白的表達。④提取腎皮質部的總RNA，采用標準曲線法進行熒光定量PCR檢測腎皮質部TGFβ1、CTGF和TIMP-1的mRNA的表達。 結果：1.24h尿蛋白定量及血液生化的變化(1)模型組，第2、4、6和8周24h尿蛋白定量、血膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)均比對照組明顯升高，各時間點水平依次升高，并且有顯2著性差異(p＜0.05)。血漿白蛋白(Alb)各時間點

5、水平依次降低，并且有顯著性差異(p＜0.01)。說明動物模型臨床表現(xiàn)為腎病綜合征，并逐漸加重并發(fā)展為腎功能衰竭。 (2)治療組，24h尿蛋白定量、血膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)及血漿白蛋白(Alb)與模型組相比較均有不同程度改善。說明GL在一定程度上可以降低蛋白尿，改善高脂血癥，對腎功能有保護作用。 2.組織病理學變化(1)模型組，光鏡下經HE、PAS和Masson染色可見，2周時系膜細胞數(shù)量增多，4

6、周后系膜細胞出現(xiàn)空泡變性；6周后出現(xiàn)局灶節(jié)段性腎小球硬化；8周后80％腎小球內出現(xiàn)玻璃樣變，腎小管萎縮呈腎小球硬化的改變。電鏡下超微結構見系膜細胞增生，線粒體腫脹，足突融合，基底膜部分增寬。6到8周足突融合加重，核漿比例失常，核內染色質疏松，電子致密物沉積，系膜基質增寬加重，在ECM中見到絲狀的膠原物質。 (2)治療組，光鏡下2周時細胞數(shù)目增加不明顯，炎性細胞浸潤輕微。4周時空泡變性明顯輕于模型組。6～8周有部分局灶節(jié)段性腎小球

7、硬化；硬化指數(shù)高于對照組(p＜0.01)，但輕于模型組(p＜0.01)。電鏡下可見系膜細胞輕度增生，線粒體腫脹減輕，足突部分融合，基底膜輕度均勻增厚。6到8周后，足突仍見部分融合，核漿比例基本正常，核內染色質輕微變化，少量電子致密物沉積，但系膜基質增寬程度輕于模型組。ECM中絲狀膠原物質少于模型組。說明甘草甜素可以改善腎臟組織的病理學變化，延緩腎小球硬化的進展。 3.ECM和TGFβ1、CTGF蛋白的變化(1)模型組，正常腎小球

8、內LN、FN和ColⅣ為弱陽性表達，隨著腎小球硬化的程度逐漸加重，腎小球內LN、FN和ColⅣ蛋白出現(xiàn)強陽性表達；在完全硬化失去正常結構的腎小球，則全部被ECM成分LN、FN和ColⅣ所占據(jù)。同時TGFβ1和CTGF在腎小球硬化早期為弱陽性表達，4～6周出現(xiàn)強陽性表達；但TGFβ1蛋白表達4周達高峰，而CTGF蛋白表達6周時達高峰。 (2)治療組，治療后LN、FN、ColⅣ、TGFβ1和CTGF蛋白表達較模型組有所減輕，但仍高于

9、對照組。說明甘草甜素可以減少ECM的沉積，使TGFβ1和CTGF蛋白表達下降，延緩腎小球硬化進展。 34.TGFβ1、CTGF和TIMP-1mRNA表達水平的變化(1)模型組，TGFβ1、CTGF和TIMP-1mRNA的表達逐漸增加，TGFβ1表達4周達高峰，CTGF和TIMP-1mRNA的表達6周達高峰。 (2)治療組，TGFβ1、CTGF和TIMP-1mRNA表達與模型組相比均有不同程度降低，表達峰值下降，但高于對照