羅格列酮對(duì)OLETF鼠糖尿病發(fā)病機(jī)制中IKK-NF-κB通路作用的初步研究.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的改變,2型糖尿病(Type2 diabetesmellitus,T2DM)已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性非傳染性疾病。
　　 羅格列酮(Rosiglitazone,RSG)作為一種新型的噻唑烷二酮類(lèi)(Thiazolidinediones,TZDs)胰島素增敏劑,在臨床上已廣泛應(yīng)用于胰島素抵抗和T2DM的治療。探討羅格列酮從胰島素抵抗和炎癥角度對(duì)T2DM發(fā)病干預(yù)作用的可能機(jī)制。具體研究分為以下兩個(gè)

2、部分:
　　 第一章羅格列酮對(duì)OLETF鼠胰島素作用的靶器官-肝臟及胰腺的形態(tài)學(xué)影響[目的]通過(guò)觀察羅格列酮對(duì)自發(fā)性T2DM大鼠模型OLETF鼠胰島素作用的靶器官-肝臟及胰腺的形態(tài)學(xué)影響,探討羅格列酮對(duì)T2DM發(fā)病的干預(yù)作用。
　　 [方法]
　　 1.以自發(fā)性T2DM大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病對(duì)照鼠LETO鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　 2.分別于8周齡、32周齡和40周齡隨機(jī)(玻璃珠法)處死大鼠。大鼠

3、宰殺后分離肝臟及胰腺組織,并分別置于10％多聚甲醛中待檢。
　　 3.以石蠟切片機(jī)間隔4um連續(xù)切片。相鄰切片分別用標(biāo)準(zhǔn)HE染色觀察大鼠肝臟及胰腺組織學(xué)改變。
　　 4.特殊染色:根據(jù)HE結(jié)果,對(duì)32周齡及40周齡的對(duì)照組及干預(yù)組大鼠肝臟以冰凍切片進(jìn)行脂肪蘇丹Ⅲ染色及淀粉酶消化前后的PAS染色,以進(jìn)一步明確病變性質(zhì)。
　　 [結(jié)果]
　　 1.8周齡時(shí),各組大鼠胰島結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差別。32周齡,干預(yù)組和對(duì)照組

4、胰島明顯比LETO組肥大,并有纖維組織長(zhǎng)入,對(duì)照組大鼠胰島纖維化更加明顯,胰島結(jié)構(gòu)不整齊。40周齡,對(duì)照組大鼠胰島形狀更不規(guī)則,纖維組織大量增生,多數(shù)胰島失去正常結(jié)構(gòu),胰島明顯萎縮。干預(yù)組大鼠胰島基本保持正常結(jié)構(gòu),無(wú)明顯肥大或萎縮,部分胰島有內(nèi)外分泌腺交錯(cuò)生長(zhǎng)或明顯的纖維化。
　　 2.8周齡時(shí),各組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)亦無(wú)明顯差別。32周齡,對(duì)照組及干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞均出現(xiàn)明顯空泡樣變性,而LETO組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)依然整齊,肝細(xì)胞以中央

5、靜脈為中心排列成索狀。40周齡,對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞空泡樣變性更加明顯,干預(yù)組較32周時(shí)改善,仍可見(jiàn)部分肝細(xì)胞空泡化。
　　 3.蘇丹Ⅲ染色結(jié)果:32周齡,干預(yù)組及對(duì)照組肝細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的脂肪變性,其中對(duì)照組肝細(xì)胞以小泡性脂肪變性為主,而干預(yù)組則為大小泡混合性脂肪變性,同時(shí)可見(jiàn)大量脂滴沉積于膽小管中；40周齡時(shí),干預(yù)組脂肪變性明顯減輕,膽小管中脂滴沉積亦減少,而對(duì)照組進(jìn)一步發(fā)展為大小泡混合性脂肪變性。
　　 4.淀粉酶消化前

6、后的糖原特殊染色--PAS染色結(jié)果:32周齡,PAS染色對(duì)照組及干預(yù)組肝細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核均可見(jiàn)豐富的紅色顆粒,經(jīng)過(guò)淀粉酶消化后PAS染色陰性,證明紅色顆粒均為糖原顆粒；40周齡,對(duì)照組肝細(xì)胞中紅色顆粒更加豐富,而干預(yù)組肝細(xì)胞中紅色顆粒明顯減少,經(jīng)淀粉酶消化后染色陰性證實(shí)為糖原。
　　 [結(jié)論]
　　 1.羅格列酮能夠通過(guò)保護(hù)OLETF大鼠胰島及肝臟的正常形態(tài)結(jié)構(gòu),達(dá)到維持胰島素作用的靶器官的生理功能作用；
　　

7、2.OLETF大鼠肝臟隨著糖尿病病程進(jìn)展,脂肪浸潤(rùn)及糖原累積逐漸加重；
　　 3.羅格列酮的短期應(yīng)用,對(duì)改善OLETF大鼠肝臟的脂肪浸潤(rùn)及糖原累積影響不大；長(zhǎng)期應(yīng)用,可改善OLETF大鼠肝臟的脂肪及糖原堆積。
　　 第二章羅格列酮對(duì)OLETF鼠IKK/NF-κB通路的影響[目的]通過(guò)羅格列酮的早期干預(yù),觀察羅格列酮對(duì)OLETF鼠IKK/NF-κB通路的影響以及胰島素敏感性相關(guān)指標(biāo)的影響,從抗炎角度探討羅格列酮對(duì)改善OLE

8、TF鼠胰島素抵抗的影響及其機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組和干預(yù)措施同第一部分2.取液氮中的肝臟及胰腺標(biāo)本,提取總蛋白,以免疫印跡(Westernblot,WB)方法測(cè)量組織中IKKβ的蛋白表達(dá)情況,凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果,檢測(cè)各組目標(biāo)蛋白條帶的灰度值,并計(jì)算目標(biāo)條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度比值,觀察IKKβ的蛋白表達(dá)情況3.取第一部分中已處理的各組大鼠的肝臟和胰腺組織蠟塊,以石蠟切片機(jī)間隔4um

9、連續(xù)切片。相鄰切片用免疫組化法標(biāo)記NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞,用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果,用陽(yáng)性單位(PositiveUnit,PU)表示NF-κB在各組大鼠肝臟及胰腺的表達(dá)情況。
　　 4.同法,石蠟切片機(jī)連續(xù)切片后,相鄰切片用免疫組化法標(biāo)記IRS-1陽(yáng)性細(xì)胞,通過(guò)凝膠圖像分析系統(tǒng),用PU表示IRS-1在各組大鼠肝臟及胰腺的表達(dá)情況。
　　 5.分析IKKβ、NF-κB及IRS-1的相關(guān)性6.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((

10、x)±s)。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩樣本間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)。多組間資料比較采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)。各因子之間的雙變量相關(guān)性采用等級(jí)相關(guān)系數(shù)(Spearman秩相關(guān)系數(shù))的非參數(shù)方法。
　　 [結(jié)果]
　　 1、羅格列酮對(duì)OLETF大鼠肝臟中IKKβ表達(dá)的影響
　　 2、羅格列酮對(duì)OLETF大鼠胰腺中IKKβ表達(dá)的影響
　　 3、羅格列酮對(duì)大鼠肝臟NF-κB表達(dá)的影響干

11、
　　 4、羅格列酮對(duì)OLETF鼠胰腺NF-κB表達(dá)的影響
　　 5、羅格列酮對(duì)大鼠肝臟IRS-1表達(dá)的影響
　　 6、羅格列酮對(duì)OLETF鼠胰腺I(mǎi)RS-1表達(dá)的影響
　　 7、肝臟中IKKβ、NF-κB與IRS-1的相關(guān)性分析
　　 8、胰腺中IKKβ、NF-κB與IRS-1的相關(guān)性分析
　　 [結(jié)論]
　　 1.羅格列酮早期干預(yù)能降低OLETF鼠IKKβ、NF-κB的表達(dá),從炎

12、癥啟動(dòng)的上游因子開(kāi)始減輕炎癥反應(yīng)對(duì)胰島素作用的靶器官肝臟和胰腺的損害。
　　 2.羅格列酮早期干預(yù)能顯著增加OLETF鼠肝臟及胰腺組織中IRS-1的表達(dá)水平,可能是其改善胰島素抵抗的機(jī)制之一。
　　 3.OLETF鼠肝臟中IKKβ表達(dá)與NF-κB的陽(yáng)性單位在各周齡時(shí)均呈高度正相關(guān)(P<0.001)；與IRS-1陽(yáng)性單位呈負(fù)相關(guān),其中32周齡和40周齡時(shí)相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.02)。在胰腺組織中有同樣的趨勢(shì)。驗(yàn)證了I