實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠脂肪肝發(fā)病機(jī)制及羅格列酮干預(yù)的研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)儲積為特征的臨床病理過程。其包括單純性脂肪肝，脂肪性肝炎(NASH)，脂肪性肝纖維化和肝硬化。流行病學(xué)調(diào)查顯示，NAFLD的人群患病率為20％，其中25％和10％的患者可分別進(jìn)展為“隱源性”肝纖維化，甚至肝硬化。NAFLD的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其中以固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP-1

2、c)及過氧化物酶體增值物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)為調(diào)控中心的糖、脂代謝紊亂，胰島素抵抗等在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要作用。羅格列酮(rosiglitizone，RSG)屬于噻唑烷二酮類藥物，是近年來應(yīng)用廣泛的胰島素增敏劑，該藥除了具有改善胰島素抵抗，降低血糖水平外，許多研究還發(fā)現(xiàn)此藥尚有改善脂質(zhì)代謝紊亂，減輕肝臟脂肪蓄積和肝臟炎性變程度等作用。因此，本研究通過喂養(yǎng)高糖高脂飲食使大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗(insuli

3、nresistance，IR)，再通過腹腔注射小劑量的鏈脲佐菌素(streptozoin，STZ)建立具有胰島素抵抗的2型糖尿病大鼠模型，并分別給予胰島素抵抗大鼠和糖尿病大鼠羅格列酮進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察各組大鼠肝臟脂質(zhì)含量變化，肝組織脂肪變程度，并應(yīng)用電鏡觀察IR及糖尿病大鼠肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，探討SREBP-1c和PGC-1α以及胰島素抵抗與糖尿病大鼠脂肪肝的關(guān)系，試闡明脂肪肝的發(fā)病機(jī)制以及羅格列酮在改善脂肪肝中的作用機(jī)制。

4、方法：首先S-D大鼠隨機(jī)分為兩組，對照組(NC組)和胰島素抵抗組(IR組)。正常對照組喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，胰島素抵抗組飼以高糖高脂飼料。8周后，從NC組及IR組各隨機(jī)抽取五只采血測定血糖和胰島素并應(yīng)用正常葡萄糖高胰島素鉗夾技術(shù)(Euglycemic insulin clamp)評價動物模型胰島素敏感性。出現(xiàn)胰島素抵抗，將IR組隨機(jī)分為兩組即胰島素抵抗組和糖尿病組。并對后者以腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，25 ng/kg)損傷部分胰腺，

5、使之出現(xiàn)高血糖。第11周把胰島素抵抗組隨機(jī)分為胰島素抵抗對照組(IR組)和胰島素抵抗應(yīng)用羅格列酮治療組(TIR組)，糖尿病組大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組(DM組)和糖尿病應(yīng)用羅格列酮治療組(TDM組)。從實(shí)驗(yàn)第11周起，TIR組和TDM組大鼠以羅格列酮2mg/kg/溶于蒸餾水灌胃，每日一次；NC組，IR組，DM組分別給予等量蒸餾水灌胃，共8周。實(shí)驗(yàn)全程共持續(xù)18周。第18周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束前測量大鼠體重，心臟采血氧化酶法測量空腹血糖(FBG)，放

6、射免疫分析法測定血清胰島素(FINS)，全自動生化分析儀測定血脂四項(xiàng)，包括：血清甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。以及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。打開腹腔充分暴露肝臟，首先觀察肝臟顏色及大小，取約1mm<'3>的肝組織以備制成電鏡切片觀察肝臟超微結(jié)構(gòu)，另外取約1 cm<'3>的肝組織制成常規(guī)石蠟切片進(jìn)行}玎巳染色，其余肝組織用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-P

7、CR)方法檢測SREBP-1c及PGC-1α基因表達(dá)水平。 結(jié)果：1、高糖高脂第8周IR組血糖較NC組有所增高，但無顯著性差異(P>0.05)。TG，TC，F(xiàn)INS較NC組升高(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。葡萄糖輸注率(glucose infusionrate，GIR)IR組明顯低于NC組(P<0.01)。DM組經(jīng)小劑量STZ腹腔注射后2周(即實(shí)驗(yàn)第10周)，血糖明顯高于NC組(P<0.01)，F(xiàn)IN較IR組降低

8、但仍高于NC組(P<0.05)。TC，TG明顯高于NC組(P<0.01)。 2、18周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，F(xiàn)BG在IR組與NC組無明顯差異，DM組較NC組仍有顯著升高。IR組和DM組大鼠的FINS，TC，TG，LDL，ALT仍較NC組高(P<0.01)，DM組體重降低(P<0.01)。TIR組和TDM組大鼠的FINS，TC，TG，LDL，ALT較各自對照組均顯著下降。 3、肝臟病理形態(tài)的改變：正常對照組肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉規(guī)

9、則，細(xì)胞中央有大而圓的核，細(xì)胞質(zhì)均勻，其內(nèi)偶見小脂滴；DM組肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂滴，肝細(xì)胞呈重度脂肪變性及肝細(xì)胞濁腫，可見少許淋巴細(xì)胞浸潤；IR組肝細(xì)胞呈中一重度脂肪變性及中度肝細(xì)胞濁腫，未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤；TDM組肝細(xì)胞內(nèi)少量細(xì)小脂滴，呈輕度脂肪變性及淋巴細(xì)胞浸潤；TIR.組肝細(xì)胞未見肝細(xì)胞脂肪變性，只有中央靜脈周圍肝細(xì)胞濁腫，偶可見少許淋巴細(xì)胞浸潤。 4、電鏡觀察NC組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，細(xì)胞核規(guī)整，線粒體豐

10、富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見異常。DM組肝細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞內(nèi)充滿了大小不等的脂滴，線粒體腫大，大部分嵴消失，膜大部分融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴(kuò)張，有明顯脫顆?，F(xiàn)象。IR組肝細(xì)胞內(nèi)亦充滿脂滴，較細(xì)小，線粒體腫大，部分嵴消失，膜部分融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，有輕度脫顆?，F(xiàn)象。TIR，TDM組肝細(xì)胞內(nèi)有細(xì)小脂滴，線粒體輕度腫大，部分嵴消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度脫顆?，F(xiàn)象。 5、SREBP-1c在IR和DM組表達(dá)明顯增加(P<0.01)，應(yīng)用羅格

11、列酮治療后有明顯下降(P<0.01)：PGC-1α在IR和DM組表達(dá)降低，應(yīng)用羅格列酮治療后有明顯上升(P<0.01)。 6、相關(guān)性分析SREBP-1c與TG、FINS、LDL、ALT呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)及P值分別為(0.935，0.000；0.662，0.010；0.783，0.001；0.961，0.000)；PGC-1α與TG，LDL呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)及P值分別為(-0.811，0.000；-0.618，0.019)。

12、 結(jié)論：1、通過8周的高糖高脂飲食，胰島素抵抗組大鼠出現(xiàn)肥胖，脂代謝紊亂和高胰島素血癥，并應(yīng)用正常葡萄糖高胰島素鉗夾技術(shù)證明IR模型復(fù)制成功。在此基礎(chǔ)上給予小劑量STZ注射后，損傷部分胰島β細(xì)胞，誘發(fā)出胰島素相對分泌障礙，胰島素抵抗持續(xù)存在。至此建立了2型糖尿病脂肪肝大鼠模型，該模型具有高血糖，血脂異常，胰島素抵抗等特點(diǎn)，與人類2型糖尿病合并脂肪肝的臨床特征類似，故此模型可用于2型糖尿病合并脂肪肝的研究。 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時利用光

13、鏡和電鏡觀察到肝臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病理改變。 3、糖尿病脂肪肝大鼠存在著嚴(yán)重的糖、脂代謝紊亂，肝臟SREBP-1c基因表達(dá)明顯升高，PGC-1α基因表達(dá)下降，這些因素既與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，也表明在高糖高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂肪變性即NAFLD發(fā)生中起著重要作用。 4、經(jīng)羅格列酮干預(yù)后，胰島素抵抗組和糖尿病組大鼠胰島素敏感性增加，各種糖、脂代謝紊亂程度明顯減輕，血清ALT水平降低，結(jié)合HE染色及電鏡結(jié)果提示羅格列酮可