一種基于新型引物設(shè)計(jì)策略的丙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)方法的研究.pdf

1、病毒感染在世界范圍內(nèi)危害著人類的健康，可以導(dǎo)致各種急性慢性疾病，甚至死亡。感染人類的病毒主要是DNA或RNA病毒，如EB病毒、人乳頭瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒等。目前普遍的治療方法是抗病毒治療，而抗病毒治療的決策、用藥的劑量、疾病的預(yù)后等的重要依據(jù)是病毒載量檢測(cè)。病毒載量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是病毒核酸的定量檢測(cè)(quantitative nucleic acid testing，NAT)，目前常用的是熒光定量PCR檢測(cè)方法。然而，標(biāo)本

2、中的病毒核酸在不恰當(dāng)?shù)牟杉?、運(yùn)送、保存和處理的情況下具有不穩(wěn)定性，若用目前現(xiàn)有的商品化試劑盒的核酸定量檢測(cè)方法檢測(cè)，病毒核酸的不穩(wěn)定性將導(dǎo)致其檢測(cè)效率降低，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。我們的目標(biāo)是建立一種方法，做到即使在病毒核酸不穩(wěn)定時(shí)，仍能盡可能地檢出患者體內(nèi)原始的病毒載量，以此來(lái)克服核酸不穩(wěn)定性對(duì)病毒載量檢測(cè)和抗病毒治療造成的影響。由于HCV RNA是典型的具有不穩(wěn)定性的病毒核酸，本文以此作為研究對(duì)象。
　　本文基于HCV RNA的降

3、解機(jī)制，發(fā)展了一種新的引物設(shè)計(jì)策略，即除了秉承經(jīng)典的引物設(shè)計(jì)原則中引物設(shè)計(jì)在保守區(qū)外，還提出了引物設(shè)計(jì)要避開(kāi)酶切位點(diǎn)，使目的片段的長(zhǎng)度盡可能短的策略，從而降低模板被酶切降解的幾率?；谠撘镌O(shè)計(jì)策略，我們建立了一種新的HCV RNA逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(reversetranscription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)方法。本方法包括了HCV RNA的引物探針設(shè)計(jì)、核酸提取和核酸擴(kuò)增三大步驟

4、。RNA的引物探針根據(jù)本文的引物設(shè)計(jì)策略進(jìn)行設(shè)計(jì);RNA提取采用的是QIAGEN的RNA提取方法，但不同的是所用的提取柱是MiRcute，該提取柱能吸附甚至＜100nt的RNA片段;RNA的擴(kuò)增用的是自建的優(yōu)化后體系和反應(yīng)條件，對(duì)RNA進(jìn)行一步法的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。為驗(yàn)證新的提取方法（MiRcute提取柱）的優(yōu)勢(shì)，我們將其與QIAGEN的RNA提取方法進(jìn)行比較，同時(shí)提取降解的HCV RNA樣本后擴(kuò)增，比較檢測(cè)的病毒載量。為驗(yàn)證新的RT-qP

5、CR方法的性能，對(duì)RT-qPCR進(jìn)行了方法學(xué)性能評(píng)價(jià)，包括線性、最低檢出限(limit of detection，LOD)、靈敏度、特異性以及和商品化試劑盒檢測(cè)的一致性。為驗(yàn)證其臨床實(shí)用性，我們對(duì)RT-qPCR方法進(jìn)行了臨床標(biāo)本檢測(cè)，并與CAP/CTM(@)和KeHua(@)對(duì)相同臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。為驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)策略的正確性，我們另外設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，擴(kuò)增依次延長(zhǎng)的目的片段，并將這3對(duì)引物與本方法中根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)的引物

6、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
　　結(jié)果顯示，第一，新的提取方法（MiRcute提取柱）比QIAGEN的RNA提取方法更有優(yōu)勢(shì)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.037)。說(shuō)明新的提取方法能夠吸附更多的降解的HCV RNA小片段，從而提高了擴(kuò)增效率。第二，新的RT-qPCR方法具有很好的方法學(xué)檢測(cè)性能:線性R2=0.99;最低檢出限LOD為46.06 IU/mL(40.65-54.07IU/mL，95％置信區(qū)間);靈敏度的批內(nèi)變異系數(shù)(coefficie

7、nt of variation，CV)為0.93％-1.34％，批間變異系數(shù)CV為1.06％-3.34％;具有100％的特異性;與商品化試劑盒CAP/CTM(@)檢測(cè)的樣本具有高度相關(guān)性(R=0.957)。第三，新的RT-qPCR方法具有良好的臨床實(shí)用性。在病毒核酸穩(wěn)定時(shí)，本文方法與商品化試劑盒CAP/CTM(@)和KeHua(@)對(duì)臨床樣本的檢測(cè)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);而當(dāng)病毒核酸不穩(wěn)定時(shí)，本文方法與商品化試劑盒CAP/CTM

8、(@)和KeHua(@)對(duì)臨床樣本的檢測(cè)相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，此時(shí)CAP/CTM(@)和KeHua(@)對(duì)不穩(wěn)定病毒核酸的檢測(cè)值都比穩(wěn)定時(shí)有所下降（其中以KeHua(@)下降的更多），而本文新的RT-qPCR方法在降解后的檢測(cè)值與降解前比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，仍然能最大限度地反映降解前患者血清中的病毒載量。第四，實(shí)驗(yàn)證明了新引物設(shè)計(jì)策略的正確性。在RNA降解樣本中，隨著目的片段的延長(zhǎng)，RNA的擴(kuò)增效率下降，即擴(kuò)增效率62-bp＞

9、157-bp＞222-bp＞304-bp，目的片段越短、避開(kāi)酶切位點(diǎn)，被酶切降解的幾率越小。
　　我們創(chuàng)新性地將二級(jí)結(jié)構(gòu)和酶切位點(diǎn)考慮到引物設(shè)計(jì)原則中，建立了新的引物設(shè)計(jì)策略。并且利用此策略成功地建立了一種新的RT-qPCR方法。該方法克服了由于標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存、處理不當(dāng)導(dǎo)致的商品化試劑盒檢測(cè)效率降低的弊端，即使在病毒核酸不穩(wěn)定的情況下，依然能最大限度地反映出其原始病毒載量，從而為臨床對(duì)HCV的診斷、治療、預(yù)后提供準(zhǔn)確依據(jù)。同