TagMan探針逆轉(zhuǎn)錄—實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測定喉癌組織中EGFR mRNA含量.pdf

1、表皮生長因子受體(EGFR)的過度表達(dá)和不恰當(dāng)激活被認(rèn)為與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),尤其在頭頸部腫瘤中EGFR表達(dá)上調(diào)最普遍,約占80﹪-100﹪.關(guān)于喉癌組織EGFR表達(dá)的研究在國內(nèi)外文獻(xiàn)中已有較多記錄.大部分研究報(bào)道喉癌組織中EGFR過度表達(dá),但是也有報(bào)道EGFR在癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)無明顯差異.以往的研究大多采用免疫組織化學(xué)染色或RT-PCR半定量技術(shù),這些方法在定量方面仍有缺陷,不同的研究結(jié)論很可能是由于喉癌組織EGFR

2、表達(dá)水平的定量研究仍缺乏準(zhǔn)確客觀的方法的緣故.TagMarl探針逆轉(zhuǎn)錄一實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是用于mRNA擴(kuò)增定量檢測的一項(xiàng)新技術(shù),與RT-PCR半定量分析、Northern印跡法等傳統(tǒng)mRNA定量方法相比,具有特異性高、穩(wěn)定性好和高通量等優(yōu)點(diǎn).本研究運(yùn)用該技術(shù)測定喉癌及癌旁組織學(xué)正常的喉黏膜組織中EGFR mRNA的表達(dá)水平,探討其應(yīng)用價(jià)值. 1.組織標(biāo)本 材料和方法收集2003年6月至2005年9月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院

3、附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科住院手術(shù)的部分喉癌病例的切除組織標(biāo)本.共32例,均為男性,年齡40-73歲,中位年齡為57.5歲.病理診斷均為鱗狀細(xì)胞癌,包括低分化4例,中分化19例,高分化9例.根據(jù)國際抗癌協(xié)會(UICC)和美國癌癥聯(lián)合會(AJCO TNM分類標(biāo)準(zhǔn)(2002)第六版:Ⅰ期5例,Ⅱ期12例,Ⅲ期8例,Ⅱ期7例.所有病例均為初發(fā)患者,術(shù)前未接受放化療.從手術(shù)切除標(biāo)本中切取小塊癌組織和癌旁陰性切緣以外的喉黏膜組織,置于預(yù)先高壓滅菌的的

4、凍存管中,立即置于液氮中并保存于-80℃冰箱. 2.方法 以Primer Express Software v2.0軟件設(shè)計(jì)EGFR的引物探針.構(gòu)建重組pGEM-T Easy/E6FR質(zhì)粒,測序鑒定后將質(zhì)粒按10倍濃度梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品. 所有組織樣本以Trizol法提取組織中總RNA,常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄,合成cDNA,將組織樣本cDNA和按10倍濃度梯度稀釋的質(zhì)粒DNA pGEM-T Easy/EGFR標(biāo)準(zhǔn)品(10<

5、'4>copies/ul-10<'7>copies/ul)以及陰性對照(ddH<,2>O)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)2.0版上以最佳PCR條件進(jìn)行EGFR檢測,同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參照.3數(shù)據(jù)分析以相對定量法計(jì)算EGFR mRNA含量,EGFR mRNA的相對含量=2<'-△cr>(ACT=EGFR的CT值-GAPDH的CT值).所得數(shù)據(jù)以SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理,經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布,故結(jié)果用中位數(shù)(四分位數(shù)間距

6、),即M(QR)表示.以Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn).重組pGEM-T Easy/EGFR質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定,與Genbank中的EGFRf芋列進(jìn)行比對,與預(yù)期完全一致.應(yīng)用TagMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測定EGFR mRNA含量的方法構(gòu)建成功.喉癌組織中EGFR mRNA相對含量中位數(shù)為0.025,其四分位數(shù)間距為0.076;癌旁組織學(xué)正常喉黏膜的EGFR mRNA相對含量中位數(shù)為0.008,其四分位數(shù)間距為0.02