肝特異表達(dá)的F蛋白的克隆及其在臨床檢驗(yàn)上應(yīng)用的研究.pdf

1、目的：肝病是影響人們健康的最重要的疾病之一，而肝癌又被稱為“癌中之王”。在我國(guó)僅乙肝病毒攜帶者就有一億多人，而其他病毒性肝炎、各種慢性肝病、肝硬化、中毒性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病以及肝臟腫瘤等人數(shù)眾多。因此，肝病的實(shí)驗(yàn)診斷就構(gòu)成了醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)的重要組成部分。然而，長(zhǎng)期以來，臨床上對(duì)肝細(xì)胞損傷的診斷更多地依賴于各種相關(guān)的酶學(xué)檢查，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等。盡管這些酶類能夠在一定的程度上反映肝臟的損害，但是酶學(xué)的

2、檢測(cè)具有一定的局限性。首先，有些酶類并不是單一地反映肝臟組織疾病的進(jìn)程，其他器官組織的疾病也可能出現(xiàn)肝臟相關(guān)酶類的變化；同時(shí)，許多反映肝臟相關(guān)疾病的酶類可以被諸多因素如藥物、毒物等所誘導(dǎo)，難以反映肝臟疾病的真正變化趨勢(shì)和程度。所以，長(zhǎng)期以來，人們希望能夠找到特異地反映肝臟細(xì)胞實(shí)質(zhì)性損傷的診斷指標(biāo)來準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床的治療和判斷預(yù)后。盡管肝臟的組織活檢能夠較真實(shí)地反映肝臟的損傷情況，但這一手段畢竟是一種有創(chuàng)的檢查，難以被患者所接受。因此，找到

3、一種即靈敏又特異地反映肝細(xì)胞損傷的簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)方法就成為我們的研究方向。 人肝臟F蛋白是一種組織特異性抗原(tissue Specific antigen，TSA)，它嚴(yán)格定位于肝臟細(xì)胞，其生物學(xué)功能尚不清楚。作為TSA的一種F蛋白在自身免疫性肝病與肝移植中的作用正逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。尤其重要的是，近年來F蛋白的基礎(chǔ)研究表明，存在于肝臟組織細(xì)胞中的F蛋白濃度與血清F蛋白的濃度之間存在著巨大差異，同時(shí)其具有嚴(yán)格的組織特異性。F蛋白的這

4、種特性奠定了它成為一種反映肝細(xì)胞損傷程度的靈敏和特異的指標(biāo)的基礎(chǔ)。 從80年代開始，人們研究血清F蛋白含量與肝臟疾病如急、慢性肝炎、肝癌和肝中毒所致肝損傷程度的關(guān)系，獲得了一些臨床數(shù)據(jù)。然而，F(xiàn)蛋白在臨床檢驗(yàn)上的應(yīng)用遇到了障礙。主要的原因是F蛋白的來源難以保證，盡管有一些學(xué)者報(bào)道采用提純的方法得到了F蛋白，但由于實(shí)驗(yàn)材料的獲得比較困難、采用的分離提純方法的不一致以及標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一等等，導(dǎo)致學(xué)者們的結(jié)果難以相互驗(yàn)證，因此目前尚沒有商

5、品的F蛋白及其診斷試劑應(yīng)用于臨床。 為了使這一能夠直接反映肝細(xì)胞損傷程度的生物學(xué)標(biāo)志蛋白早日在肝病的實(shí)驗(yàn)診斷中發(fā)揮作用，滿足臨床的需要，本文試圖采用分離提純和基因工程的方法得到F蛋白，使這兩種方法獲得的F蛋白相互驗(yàn)證建立標(biāo)準(zhǔn)解決上述問題。因此，本文做了如下工作：人和大鼠肝臟特異F蛋白的克隆與表達(dá)、人肝臟組織F蛋白的提純、 F蛋白診斷試劑的研制及其在臨床檢驗(yàn)上應(yīng)用的初步探討以及與肝臟腫瘤相關(guān)的C53蛋白在肝癌、膽管癌和肝纖維化組織

6、中的表達(dá)等研究。 方法：論文第一部分，分別提取大鼠和人肝臟總RNA，確定其純度和完整性后對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR(RT-PCR)擴(kuò)增出目的基因(F—protein’s cDNA)，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)目的基因，然后將大鼠和人的目的基因分別與pUCm—T載體進(jìn)行連接獲得克隆質(zhì)粒pUCm-T-F并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中；將結(jié)果正確的克隆片斷與表達(dá)載體：pET-15b連接，獲得F蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET15b—F并將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21

7、(DE3)pLysS中，用1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)大鼠和人的目的蛋白，表達(dá)后的全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，用Ni<'2+>-charged IDA His—bind coluiiln對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，并最終用Western—blot進(jìn)行鑒定。論文 第二部分，將取白手術(shù)來源的人肝臟組織，經(jīng)低溫勻漿、飽和硫酸氨沉淀粗提后再經(jīng)DEAE—Cellulose 52、Sephacryl S-200和CM—Cellulose-23

8、柱層析，最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。在人肝臟F蛋白提純的過程中，每一步均經(jīng)用BALB/c小鼠肝勻漿免疫C3H小鼠的抗F蛋白抗血清，進(jìn)行F蛋白提純過程的鑒定，分離過程中所選取的沉淀、層析各部分與小鼠抗F蛋白抗血清均出現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)的沉淀帶。純度鑒定采用SDS--聚丙烯酰胺凝膠電泳。 論文第三部分，用Ni<'2+>—charged IDA HiSIbind column純化的人肝臟F蛋白作為抗原免疫兔得到F蛋白的多克隆抗體；用間接

9、ELISA法及Westem blot法分別對(duì)制備的多克隆抗體的效價(jià)和特異性進(jìn)行測(cè)定；對(duì)用此多克隆抗體作為ELISA診斷試劑的指標(biāo)進(jìn)行分析；用此試劑檢測(cè)收集的90例肝病患者(其中肝硬化39例、肝細(xì)胞癌15例、急性乙型肝炎21例、慢性乙型肝炎15例)、28例其他非肝臟疾病患者(心絞痛、糖尿病、腦梗塞、高血壓)和32例新生兒血清與50例對(duì)照血清標(biāo)本。 論文第四部分，選取來自天津市第三中心醫(yī)院2005年4月至2007年2月期間住院并有明

10、確臨床診斷的肝臟腫瘤和肝纖維化患者組織標(biāo)本，其中高分化肝細(xì)胞癌及癌旁組織各5例，中低分化肝細(xì)胞癌及癌旁組織各5例，肝內(nèi)膽管癌及癌旁組織各5例，早期輕微肝臟纖維化5例。用近期文獻(xiàn)特征的一個(gè)新的C53蛋白的抗體，采用常規(guī)修復(fù)方法進(jìn)行免疫組化染色和鏡檢分析，探討C53蛋白在各種類型肝臟腫瘤組織中表達(dá)的差異。 結(jié)果：第一部分，克隆與表達(dá)了大鼠F蛋白，表達(dá)后的全菌蛋白的SDS.PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，目的帶分子量約為43kD，與預(yù)期值相

11、符；其表達(dá)量約為全菌總蛋白量的40％；表達(dá)的F蛋白與豚鼠抗人F蛋白多克隆抗血清呈陽性反應(yīng)。人肝臟F蛋白的克隆與表達(dá)結(jié)果顯示，目的基因?yàn)?134bp，與Gene-bank所提供的大鼠F蛋白基因編碼序列大小相近。誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，其目的蛋白的大小約為43kD；Western-blot結(jié)果顯示，表達(dá)的人肝臟特異F蛋白與豚鼠抗人F蛋白多克隆抗體發(fā)生了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，提示，經(jīng)基因工程方法得到的人F蛋白具有免疫

12、活性，可用于后續(xù)的臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分，人肝臟組織勻漿含總蛋白50427 mg，經(jīng)離心和硫酸氨沉淀后獲得了5468rag的粗制F蛋白，經(jīng)DEAE-Cellulose 52、Sephacryl S-200、CM-Cellulose-23柱層析后分別獲得1690、610和48mg F蛋白富集的蛋白組分。在人肝臟F蛋白提純的過程中，對(duì)所得到的各蛋白組分分別用BALB/c小鼠肝勻漿免疫C3H小鼠的抗F蛋白抗血清進(jìn)行鑒定的結(jié)果顯示

13、，均出現(xiàn)陽性免疫反應(yīng)沉淀帶。分離純化后的F蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到了分子量為43 KD的優(yōu)勢(shì)條帶，與文獻(xiàn)報(bào)道的F蛋白分子量一致。 第三部分，用人肝組織來源克隆表達(dá)的F蛋白免疫兔所得的抗血清免疫效價(jià)可達(dá)1：25600，抗血清用于F蛋白檢測(cè)試劑的靈敏度和免疫交叉反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.5ug/孔(10 ug/m1)；批內(nèi)重復(fù)性CV值在5.5％、批間重復(fù)性CV值在10％左右；F蛋白檢測(cè)與HbsAg、HbeAg、H

14、AV、HCV、HDV、HEV、HSⅥ、HSⅦ等抗原和大腸桿菌無免疫交叉反應(yīng)；抗原和抗體反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)為最佳反應(yīng)時(shí)間；該試劑在4。C，保存6個(gè)月后P/N比值下降15％左右，而且陽性血液標(biāo)本稀釋100倍其P/N比值仍在線性范圍內(nèi)。采用雙夾心法分析人血清標(biāo)本結(jié)果顯示，39例肝硬化患者中有19例呈陽性反應(yīng)，占48％；15例肝腫瘤患者中100％呈陽性反應(yīng)；21例急性乙肝患者中90％呈陽性反應(yīng)；15例慢性肝炎患者中30％呈陽性反應(yīng)；非肝臟疾病患者(

15、心絞痛、糖尿病、腦梗塞、高血壓)共28例只有一例出現(xiàn)陽性結(jié)果；32例新生兒血清F蛋白結(jié)果均為陰性；50例正常對(duì)照血清標(biāo)本中，有3例呈弱陽性反應(yīng)，其余均為陰性，各組結(jié)果與正常對(duì)照比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第四部分，對(duì)肝腫瘤組織和肝纖維化組織切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C53蛋白在肝癌組織中有較強(qiáng)表達(dá)(++以上)，在癌旁組織中有弱表達(dá)(+-)，在早期輕微肝纖維化組織中沒有表達(dá)(-)。初步表明C53蛋白與肝臟腫瘤相關(guān)。 結(jié)論：用基因工程技術(shù)首次

16、從人肝組織中克隆與表達(dá)了肝特異性F蛋白，在Gene-bank上發(fā)布了序列號(hào)為DQl88836的人肝F蛋白的cDNA序列。在此基礎(chǔ)上從大鼠和人的肝臟克隆表達(dá)得到的F蛋白和從人的肝臟中提純獲得的F蛋白的分子量與文獻(xiàn)報(bào)道一致。提示在不同種屬動(dòng)物中F蛋白功能的相似性。 克隆表達(dá)的大鼠F蛋白、人F蛋白與人肝臟組織純化的F蛋白免疫豚鼠所獲得的抗人F蛋白多克隆抗體均具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，表明所克隆的大鼠和人的F蛋白均具有人肝臟F蛋白的免疫活性。

17、 本文所選用的分離提純方法是在綜合了前人的工作經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定的，尤其是小鼠抗F蛋白抗血清在分離過程中的使用使得整個(gè)提純過程更加嚴(yán)謹(jǐn)。提純的F蛋白與克隆得到的F蛋白的相互驗(yàn)證使F蛋白的系統(tǒng)研究工作更加完善，也進(jìn)一步證明了F蛋白的肝臟特異性。 采用克隆人肝臟特異F蛋白免疫兔所得到用于臨床使用的多克隆F蛋白抗血清作為診斷試劑，其靈敏度和特異性能夠初步滿足臨床分析各種肝病患者標(biāo)本的需要。分析結(jié)果顯示，F(xiàn)蛋白這一指標(biāo)對(duì)肝病的診斷具