CKS1B基因促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖與病程惡化的SKP2-P27非依賴(lài)性機(jī)制研究.pdf

1、本文為了進(jìn)一步闡述CKS1B影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生存和增殖的分子機(jī)制，以及研究CKS1B在多發(fā)性骨髓瘤疾病預(yù)后中所起的作用，進(jìn)行了如下研究，并取得了相應(yīng)的結(jié)果：
　　 1.CKS1B在多發(fā)性骨髓瘤病人中表達(dá)水平增高，并隨病情進(jìn)展而升高
　　 本文用骨髓瘤病人骨髓中腫瘤細(xì)胞mRNA做基因芯片分析，比較了51個(gè)病人從剛確診到復(fù)發(fā)后的CKS1B表達(dá)水平的變化，Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，在以初診-復(fù)發(fā)配對(duì)比較

2、的51位病人中，和那些從初診斷到復(fù)發(fā)CKS1B表達(dá)水平?jīng)]有明顯增高的病人相比，增高1.5倍以上的36位病人復(fù)發(fā)后4年的生存率顯著性的低。證實(shí)了CKS1B在多發(fā)性骨髓瘤的診斷階段是個(gè)診斷指標(biāo)，并且也是個(gè)預(yù)示病人預(yù)后不良的指標(biāo)。
　　 2.CKS1B基因過(guò)表達(dá)表達(dá)促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖并提高細(xì)胞的耐藥性
　　 利用lentenvirus病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，建立了CKS1B過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。細(xì)胞分別在含1％、5％、10％胎牛血

3、清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，與轉(zhuǎn)染空白載體的對(duì)照組細(xì)胞相比，CKS1B高表達(dá)的骨髓瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的增殖率,實(shí)驗(yàn)證明，CKS1B能促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖。證明了CKS1B高表達(dá)誘發(fā)了骨髓瘤細(xì)胞對(duì)多種抗腫瘤藥物耐藥。
　　 3.CKS1B基因通過(guò)SKP2-p27依賴(lài)和非依賴(lài)性途徑影響骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和生存
　　 本課題組為了研究CKS1B基因促進(jìn)骨髓瘤生長(zhǎng)和疾病進(jìn)程的機(jī)制，在骨髓瘤細(xì)胞中，CKS1B基因敲除引起SKP2表達(dá)降低和p2

4、7表達(dá)上調(diào)，并且導(dǎo)致強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制。試驗(yàn)結(jié)果提示CKS1B是通過(guò)SKP2-p27依賴(lài)性和非依賴(lài)性途徑影響骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和生存，并且SKP2-p27非依賴(lài)性途徑可能更重要一些。
　　 4.臨床分析和信息學(xué)分析提示CKS1B基因可能主要通過(guò)SKP2-p27非依賴(lài)性途徑影響骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和疾病進(jìn)程
　　 為了進(jìn)一步證實(shí)CKS1B影響骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制中的確存在SKP2-p27非依賴(lài)性途徑，在351個(gè)接受TT2治療方

5、案的多發(fā)性骨髓瘤新診斷病人中，利用Kaplan-Meier生存曲線分別比較CKS1B高/低表達(dá)、SKP2高/低表達(dá)以及p27低/高表達(dá)病人的生存率。結(jié)果顯示，CKS1B高表達(dá)的病人生存期明顯短于低表達(dá)的病人，P<0.001；而SKP2高、低表達(dá)的病人生存時(shí)間沒(méi)有明顯的差異；p27低、高表達(dá)的病人生存時(shí)間也沒(méi)有明顯的差異。
　　 這個(gè)臨床證據(jù)表明，CKS1B、SKP2和p27對(duì)多發(fā)性骨髓瘤疾病進(jìn)程的影響不同，只有CKS1B的表達(dá)顯

6、著影響疾病的進(jìn)行和惡化。
　　 5.骨髓瘤細(xì)胞中CKS1B非依賴(lài)SKP2-P27激活STAT3，MEK/ERK和BCL2信號(hào)途徑
　　 根據(jù)信息學(xué)分析的提示，在CKS1B基因敲除骨髓瘤細(xì)胞系OCI-MY5中，通過(guò)Western-Blot篩選了MAPK，NF-kB，TP53，P13K/AKT,STAT3等重要細(xì)胞信號(hào)途徑的主要信號(hào)分子。檢測(cè)到在骨髓瘤細(xì)胞OCI-MY5中，CKS1B基因敲除后引起下列信號(hào)分子蛋白表達(dá)下調(diào)。<

7、br>　　 為了進(jìn)一步明確STAT3，MEK/ERK，BCL2是CKS1B的下游調(diào)控分子，通過(guò)Western-Blot檢測(cè)了CKS1B cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞系OCI-MY5和XG1中以上分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，在CKS1B外源性高表達(dá)的細(xì)胞中，p-MEK1/2，p-ERK1/2，p-STAT3，MCL-1，和P—BCL2表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)，STAT3，MEK/ERK，BCL2是CKS1B的下游調(diào)控分子，CKS1B可能通過(guò)它們影響骨髓瘤細(xì)

8、胞生長(zhǎng)和生存。
　　 6.CKS1B通過(guò)激活STAT3/MCL1信號(hào)通路促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖和生存
　　 胰島素樣生長(zhǎng)因子1是得到公認(rèn)的骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能激活STAT3信號(hào)途徑，促進(jìn)STAT3磷酸化。為了研究STAT3在CKS1B促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖和生存中所發(fā)揮的作用，用含IGF-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)CKS1B基因敲除的KMS28PE,OCI-MY5，和XG1細(xì)胞72小時(shí)。Western-Blot證實(shí)，在IGF-1培養(yǎng)的細(xì)胞

9、p-STAT3，MCL1表達(dá)增高。CKS1B基因敲除的細(xì)胞，通過(guò)IGF-1上調(diào)p-STAT3的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡和抑制生長(zhǎng)被部分阻止。以上結(jié)果證明了CKS1B通過(guò)激活STAT3/MCL1影響骨髓瘤細(xì)胞的增殖和生存。
　　 抗生素肖夫齊特，已被證明是JAK/STAT信號(hào)通路的特異性抑制劑，能夠在骨髓里細(xì)胞中抑制STAT3的磷酸化。為了證明JAK/STAT3是CKS1B下游信號(hào)通路并觀察靶向阻斷STAT3通路對(duì)CKS1B高表達(dá)骨髓瘤細(xì)

10、胞生長(zhǎng)的影響，將CKS1B轉(zhuǎn)染的骨髓瘤細(xì)胞OCI-MY5和XG1，在含10nM Nif培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。WB驗(yàn)證，Nif處理后的細(xì)胞p-STAT3蛋白水平下降。與EV細(xì)胞相比，CKS1B轉(zhuǎn)染的OCI-MY5和XG1細(xì)胞有更高的細(xì)胞死亡率。CKS1B高表達(dá)的細(xì)胞對(duì)STAT3特異性抑制劑Nifi誘發(fā)的細(xì)胞凋亡更敏感。
　　 7.CKS1B通過(guò)激活MEK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖和生存
　　 在CKS1B基因敲除后

11、的細(xì)胞中，通過(guò)LentiVirus轉(zhuǎn)染MEK1-cDNA，使MEK1基因特異性高表達(dá)。WB驗(yàn)證MEK1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后p-MEK1/2和p-ERK1/2表達(dá)大幅度增加，并且磷酸化p-BCL2被激活。說(shuō)明轉(zhuǎn)染MEK1導(dǎo)致的MEK/ERK通路的激活，抵消了CKS1B基因敲除導(dǎo)致的bcl2下調(diào)，從而證明BCL2是MEK/ERK下游調(diào)控分子。MEK1基因高表達(dá)，同時(shí)CKS1B基因敲除的骨髓瘤細(xì)胞KMS28PE,OCI-MY5，和XG1，雖然仍存在細(xì)胞

12、凋亡和生長(zhǎng)受抑制，但是與單純CKS1B基因敲除的細(xì)胞相比較，細(xì)胞死亡率顯著性降低，存活細(xì)胞總數(shù)也顯著性增多。由此證明，MEK/ERK的外源性高表達(dá)和磷酸化激活，部分抵消了CKS1B基因敲除引起的骨髓瘤細(xì)胞死亡和生長(zhǎng)抑制。以上研究證明，CKS1B通過(guò)激活MEKK/ERK通路，以及其下游的BCL2通路，影響骨髓瘤細(xì)胞的增殖和生存.
　　 8.BCL2信號(hào)通路的激活與CKS1B介導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞增殖和存活相關(guān)
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)

13、提示BCL2是CKS1B和MEK/ERK信號(hào)通路的下游調(diào)控分子，為了確證BCL2在CKS1B促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制所起的作用，在CKS1B基因敲除后細(xì)胞中，通過(guò)LentiVirus轉(zhuǎn)染BCL2-cDNA，使BCL2過(guò)表達(dá)。Western-Blot驗(yàn)證p-BCL2磷酸化被激活。BCL2過(guò)表達(dá)，同時(shí)CKS1B基因敲除的骨髓瘤細(xì)胞，雖然仍存在細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制，但是與單純CKS1B基因敲除的細(xì)胞相比較，細(xì)胞死亡率顯著性降低，存活細(xì)胞總數(shù)也顯

14、著性增多。由此證明，BCL2的外源性高表達(dá)和BCL2磷酸化，部分抵消了CKS1B基因敲除引起的骨髓瘤細(xì)胞死亡和生長(zhǎng)抑制。以上研究證明了，BCL2在CKS1B促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖和生存的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 9.對(duì)CKS1B高表達(dá)的細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用STAT3、MEK和BCL2抑制劑，存在協(xié)同作用
　　 由于CKS1B通過(guò)激活MEK/ERK和STAT3信號(hào)通路促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，靶向于這2條通路的藥物聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)對(duì)骨髓瘤

15、細(xì)胞造成更強(qiáng)有力的殺傷效果。
　　 使用STAT3抑制劑聯(lián)合MEK1抑制劑，或者聯(lián)合BCL2抑制劑，處理CKS1B高表達(dá)的骨髓瘤細(xì)胞OCI—MY5Y。結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用這2條信號(hào)通路抑制劑，都對(duì)CKS1B高表達(dá)細(xì)胞和空白對(duì)照細(xì)胞造成強(qiáng)烈的細(xì)胞毒作用，而CKS1B過(guò)表達(dá)細(xì)胞的死亡率顯著更高，效果強(qiáng)于單獨(dú)用藥。我們又在CKS1B高表達(dá)的細(xì)胞XG1中重復(fù)了這一實(shí)驗(yàn)，得到相同的結(jié)果。這一實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了，與CKS1B表達(dá)低的骨髓瘤細(xì)胞相比

16、，對(duì)CKS1B高表達(dá)的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)用STAT3和MEK/ERK抑制劑治療方案，療效會(huì)更好。
　　 10.FOXM1在骨髓瘤細(xì)胞中抑制CKS1B的表達(dá)并上調(diào)P27，同時(shí)也被P27正反饋調(diào)控
　　 CKS1B在多發(fā)性骨髓瘤病人中高表達(dá)已經(jīng)被多個(gè)研究者所證實(shí)，而CKS1B在骨髓瘤細(xì)胞中增高的機(jī)制，除了與染色體1q21區(qū)域擴(kuò)增外相關(guān)，并無(wú)更多的研究。
　　 有文獻(xiàn)報(bào)道在人骨肉瘤中，轉(zhuǎn)錄因子FOXM1能上調(diào)CKS1的表達(dá)，

17、臨床觀察和實(shí)驗(yàn)室資料也發(fā)現(xiàn)FOXM1高表達(dá)的MM病人預(yù)后差。為了研究FOXM1與CKS1B之間的關(guān)系，我們建立了FOXM1高表達(dá)骨髓瘤細(xì)胞系，WB驗(yàn)證FOXM1過(guò)表達(dá)引起CKS1B蛋白水平上調(diào)，和P27蛋白水平下調(diào)；而WB也顯示，CKS1B基因敲除后并沒(méi)有引起FOXM1表達(dá)水平的變化，而P27過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致FOXM1表達(dá)增加。因此FOXM1是CKS1B的上游調(diào)控基因，能抑制CKS1B從而減少P27的降解，但是當(dāng)P27的表達(dá)增高時(shí)，反過(guò)來(lái)又

18、促進(jìn)了FOXM1的表達(dá)，F(xiàn)OXM1-CKS1B-P27之間存在相互作用的調(diào)控關(guān)系。
　　 小結(jié)：本課題的研究，探討了CKS1B在骨髓瘤中過(guò)表達(dá)的機(jī)制，證實(shí)了骨髓瘤細(xì)胞中CKS1B接受轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的正向調(diào)控；證明了CKS1B基因促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)存活和對(duì)多種抗腫瘤藥物耐藥疾??；闡述了CKS1B促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的SKP2-p27非依賴(lài)性機(jī)制，證實(shí)CKS1B通過(guò)激活STAT3,MEK/ERK/BCL2信號(hào)通路促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)