藤黃酸通過調(diào)節(jié)PDGF受體β酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制大鼠主動脈平滑肌細胞的增殖與遷移.pdf

1、血管平滑肌細胞異常的增殖和遷移在動脈硬化和血管損傷后再狹窄中起著重要的作用。而PDGF(platelet derived growth factor，血小板衍生生長因子)是已知重要的血管平滑肌細胞異常增殖與遷移的刺激因子。較多的證據(jù)顯示PDGF-BB和PDGF受體β介導的信號通路在血管重塑和血管損傷后新生內(nèi)膜形成中起著極其重要的作用。因此，在病變形成過程中，它常被作為一個藥物治療戰(zhàn)略的靶點。PDGFR的激活與一系列酪氨酸同源區(qū)2相關(guān)的蛋

2、白有關(guān)，包括：RasGAP，磷脂酰肌醇(-3)激酶(P13K)和磷脂酶C(PLC)γ1，這些分子又進一步誘導特異性信號級聯(lián)反應(yīng)，激活PDGFR下游信號ERK，AKT，JNK和小分子蛋白rho及Rac1，這些信號參與了PDGF誘導的細胞反應(yīng)：增殖和遷移。
　　 Rac1屬于Rho GTP酶家族，既往報道Rac1活化在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移、細胞周期調(diào)控及凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。除此之外，在一些細胞系中PDGF-BB可通過激活G-

3、蛋白：Rac1和Cdc42，并在在其增殖和運動起著重要的作用。β-catenin是一種細胞骨架蛋白，由位于染色體3p21-22的ctnnb1基因編碼。當受到細胞因子激活后，β-catenin進入細胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子引起細胞的增殖，已有報道在血管平滑肌細胞的增殖中起著重要的作用。β-catenin入核受經(jīng)典的wnt激活，也受JNK、AKT、E-cadherin等分子的調(diào)控。Wu等的文章表明Rac1和JNK活化能促進β-catenin進入

4、細胞核并調(diào)控細胞的增殖和胚胎肢體的長出。PDGF-BB能誘導β-catenin進入血管平滑細胞核并促進其增殖與遷移，但Rac1活化是否在PDGF-BB誘導的β-catenin核內(nèi)聚集中起著重要的調(diào)控作用卻不清楚。
　　 藤黃樹產(chǎn)自中國及東南亞地區(qū)，中醫(yī)藥文獻報道藤黃樹脂具有較強的止血、抗炎、抗氧化和抗感染作用。藤黃酸是(Gambogic Acid，GA)藤黃樹脂中提取的有效成分，既往的研究報道GA可通過抑制AKT，ERK，c-S

5、rc，F(xiàn)AK和VEGFR2等起到較強的抗癌、抗炎和抑制血管新生的作用。但GA是否能抑制PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移以及其內(nèi)在的分子機制尚未可知。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)：Rac1與JNK相互作用在PDGF-BB誘導的β-catenin核內(nèi)聚集中起著重要調(diào)節(jié)作用，而GA通過影響PDGFR酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制了大鼠主動脈平滑肌細胞的增殖與遷移。本研究分2部分，現(xiàn)摘要如下：
　　 第一部分：
　　

6、PDGF-BB激活Rac1調(diào)控大鼠主動脈平滑肌細胞β-catenin的核內(nèi)外分布
　　 目的：既往的研究基礎(chǔ)提示JNK和Rac1可能在PDGF-BB刺激引起的β-catenin入核中可能起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此本研究觀察了JNK與Rac1的相互作用及其在PDGF-BB誘導β-catenin核內(nèi)外分布和細胞增殖及遷移的作用。
　　 方法：(1)取SD大鼠胸主動脈貼塊法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞，并依靠細胞的形態(tài)和免疫組織化學

7、方法對細胞進行鑒定。(2)設(shè)計大鼠Rac1siRNA三對，western法篩選，最有效者應(yīng)用于實驗。(3)CCK8試劑盒和Transwell小室分別檢測不同濃度Rac1抑制劑NSC23766(25、50、100μmol/L)和Rac1siRNA(50nmol/L)對PDGF-BB(50μg/L)誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響。(4)為確定PDGF-BB對Rac1活性、pi-JNK表達和β-catenin核內(nèi)聚集的時間特性，PDGF

8、-BB刺激后在多個時間點檢測上述指標的變化，分別于PDGF-BB刺激0、1、5、15、30、60min后應(yīng)用GST-pulldown法檢測Rac1活性，0、5、15、30、60、120min應(yīng)用western blotting檢測pi-JNK的表達，0、15、30、60、120、240min提取胞漿-胞核蛋白western blotting檢測β-catenin核內(nèi)表達。(5)為檢測Rac1活化對PDGF-BB誘導的β-catenin的

9、核內(nèi)聚集和pi-JNK的影響。血管平滑肌細胞給予NSC23766和Rac1siRNA處理后，予以PDGF-BB刺激相應(yīng)時間，檢測Rac1活性受到抑制后PDGF-BB誘導的β-catenin的核內(nèi)聚集和pi-JNK表達的變化。(6)為檢測JNK的磷酸化是否對PDGF-BB誘導的β-catenin的核內(nèi)聚集和Rac1活化也有作用，血管平滑肌細胞給予SP600125處理后，予以PDGF-BB刺激相應(yīng)時間，檢測JNK磷酸化受到抑制后PDGF-B

10、B誘導的β-catenin的核內(nèi)聚集和Rac1活性表達的變化。(7)為進一步證實Rac1和JNK活化對PDGF-BB誘導β-catenin核內(nèi)聚集的影響，血管平滑肌細胞予以NSC23766、Rac1siRNA和SP600125處理后，PDGF-BB刺激1h后免疫熒光檢測β-catenin的核內(nèi)外分布變化。
　　 結(jié)論：Rac1活化與JNK的磷酸化之間存在相互作用，并在PDGF-BB誘導血管平滑細胞β-catenin核內(nèi)聚集中起著

11、關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，抑制Rac1活化能顯著抑制PDGF-BB誘導的大鼠主動脈平滑肌細胞的增殖和遷移。
　　 第二部分：
　　 藤黃酸通過調(diào)節(jié)PDGFR酪氨酸磷酸化及Rac1活性抑制大鼠主動脈平滑肌細胞的增殖與遷移
　　 目的：藤黃酸是(Gambogic Acid，GA)藤黃樹脂中提取的有效成分，既往的研究報道GA可通過抑制AKT，ERK，c-Src，F(xiàn)AK和VEGFR2等起到較強的抗癌、抗炎和抑制血管新生的作用。但G

12、A是否能抑制PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移以及其內(nèi)在的分子機制尚未可知。本實驗對GA是否影響了PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移，以及其對增殖與遷移產(chǎn)生抑制作用的內(nèi)在分子分子機制進行了研究。
　　 方法：(1)MTT法和[3H]-胸腺嘧啶摻入法檢測了不同濃度GA(0.25μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L，2.0μmol/L)對PDGF-BB和EGF誘導的血管平滑肌細胞增殖的影響。(2)

13、流式細胞儀檢測不同濃度GA對PDGF-BB和EGF誘導的細胞周期轉(zhuǎn)換的影響。(3)PI/Annexin熒光雙染流式細胞儀檢測GA是否造成了細胞的死亡或凋亡。(4)Transwell小室檢測了不同濃度GA(0.25μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L，2.0μmol/L)對PDGF-BB誘導的血管平滑肌細胞遷移的影響。(5)Western blotting檢測了不同濃度GA對EGF誘導的EGFR、PDGF-BB誘導的PDG

14、FR及其下游信號PLCγ1，ERK，AKT，JNK活化的影響，以及對細胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclinD1，cyclinE，CDK2和CDK4)的影響。(5)GST-pulldown法檢測不同濃度GA對PDGF-BB誘導的Rac1活化的影響。(6)為進一步檢測GA作用的分子機制，酪氨酸活性檢測(酪氨酸磷酸化表達)和斑點結(jié)合實驗被應(yīng)用于實驗，以檢測GA是否造成PDGF-BB和EGF誘導的酪氨酸磷酸化障礙以及GA是否在體外與PDGF-BB和EG