粉塵螨舌下含服疫苗對粉塵螨變應(yīng)原誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性哮喘的實驗研究.pdf

1、目的： 探討標準化粉塵螨舌下含服疫苗和輔以殼聚糖納米粒子為佐劑的粉塵螨舌下含服疫苗對粉塵螨變應(yīng)原誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性小鼠哮喘模型的免疫治療療效及作用機理。為標準化粉塵螨舌下含服疫苗以及粉塵螨殼聚糖納米舌下含服疫苗的研制及產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。 內(nèi)容與方法： 1、將24只Balb/c小鼠隨機分為4組：陰性對照組(A組)、PBS對照組(B組)、低劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗組(C組)、高劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗組(D組)。

2、A組始終采用生理鹽水處理。其余各組小鼠用粉塵螨變應(yīng)原致敏后，分別用相應(yīng)試劑對小鼠進行了舌下免疫，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清中IgA、IgE與IgG2a抗體及脾細胞因子變化。 2、雌性Balb/c小鼠24只，將動物隨機分為陰性對照組(A組)、模型對照組(B組)、低劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗組(C組)和高劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗組(D組)，每組6只。A組始終采用生理鹽水處理，其余各組用粉塵螨變應(yīng)原致敏后，小鼠被

3、分別給予相應(yīng)試劑進行舌下治療，再用粉塵螨變應(yīng)原滴鼻激發(fā)；末次激發(fā)24小時后，檢測氣道高反應(yīng) (airway hyper-reactivity，AHR)；通過HE染色 (haematoxylin and eosin) 和AB染色 (Alcian B1ue) 觀察小鼠肺部炎癥和粘液分泌；觀察支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數(shù)和細胞分類；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測BALF中白細胞介素10(IL-10)、白細胞介素4(IL-4)、

4、γ干擾素(IFN-γ)及血清中的Ign、IgE和IgG2a抗體；同時檢測脾細胞在變應(yīng)原特異刺激下分泌的IL-10、IL-4和IFN-γ水平；MTT法檢測脾淋巴細胞增殖情況，用流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中的調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量。 3、通過沉淀/凝聚法制備粉塵螨殼聚糖納米粒子，檢測粒徑、包封率；瓊脂糖凝膠電泳和紅外光譜(FT—IR)檢測納米粒子包裹情況；用 Western-Blot 法檢測粉塵螨變應(yīng)原結(jié)合殼聚糖后的活性變化；觀察其體外釋放情況。用

5、異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記模式蛋白質(zhì)BSA，Sephadex G25純化獲得熒光標記蛋白，制備TRITC標記：BSA殼聚糖納米粒子，將該納米粒子舌下含服給予小鼠，運用激光共聚焦顯微鏡觀察不同時間段小鼠粘膜、頸部淋巴結(jié)和胃腸道中熒光物質(zhì)的變化。 雌性Balb/c小鼠30只，將動物隨機分為陰性對照組(A組)、模型對照組(B組)、空白殼聚糖納米組(C組)、標準化粉塵螨舌下含服疫苗組(D組)和粉塵螨一殼聚糖納米舌下含服疫苗組(負荷

6、與D組等劑量的粉塵螨變應(yīng)原)(E組)，每組6只。Saline組始終采用生理鹽水處理。其余各組用粉塵螨變應(yīng)原致敏后，小鼠被分別給予相應(yīng)試劑進行舌下治療，再用粉塵螨變應(yīng)原滴鼻激發(fā)；末次激發(fā)24小時后，檢測氣道高反應(yīng)(AHR)，通過HE染色和AB染色觀察小鼠肺部炎癥和粘液分泌；觀察BALF中細胞總數(shù)和細胞分類；用EIASA法檢測BALF中IL-10、IL-4、IFN-γ及血清中的IgA、IgE和IgG2a抗體；同時檢測脾細胞在變應(yīng)原特異刺激下

7、分泌的IL-10、IL-4和IFN-γ；MTT法檢測脾淋巴細胞增殖情況，流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中的調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量。 結(jié)果： 1、高劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗通過舌下免疫已致敏Balb/c小鼠能明顯誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答IgA抗體產(chǎn)生，降低變應(yīng)原特異性IgE，脾細胞因子以IL-10為主。 2、高劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗能有效抑制變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性、炎癥細胞侵潤和粘液分泌；降低BALF中IL-4濃度，升高I

8、L-10的水平；能升高小鼠血清中變應(yīng)原特異性IgA抗體，抑制變應(yīng)原特異性IgE產(chǎn)生；在粉塵螨變應(yīng)原刺激下，高劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗的小鼠脾細胞主要分泌IL-10，脾細胞變應(yīng)原特異性增殖受抑制，調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量比模型對照組顯著升高。 3、成功制備了粉塵螨殼聚糖納米粒子，殼聚糖對粉塵螨變應(yīng)原的包裹率60％，負荷率為15.6％。變應(yīng)原被成功結(jié)合到殼聚糖上，活性基本不受制備過程的影響。 異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記的

9、BSA殼聚糖納米粒子，通過舌下含服給藥，顯示1小時內(nèi)在粘膜下出現(xiàn)熒光標記物，熒光標記物可被腸道吸收。以殼聚糖為佐劑的粉塵螨變應(yīng)原舌下含服疫苗能有效抑制變應(yīng)原誘導(dǎo)的AHR、炎癥細胞侵潤和粘液分泌；明顯降低BALF中IL-4濃度，升高IL-10和IFN-γ的水平，能升高小鼠血清中抗原特異性IgA抗體，抑制IgE產(chǎn)生；小鼠脾細胞在粉塵螨變應(yīng)原刺激下主要分泌IFN-γ、IL-10，且脾淋巴細胞中的調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量比模型對照組增高。 結(jié)論

10、： 1、高劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗免疫致敏Balb/c小鼠，能明顯誘導(dǎo)IL-10生成，誘導(dǎo)變應(yīng)原特異性IgA抗體產(chǎn)生，而抑制特異性IgE抗體生成。 2、高劑量標準化粉塵螨舌下含服疫苗，通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞、IL-10和特異性IgA抗體，抑制Th2型免疫應(yīng)答和血清IgE抗體，減輕粉塵螨變應(yīng)原誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性哮喘癥狀。 3、以殼聚糖為佐劑的粉塵螨舌下含服納米疫苗免疫治療，能夠促進舌下粘膜吸收，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞、I