2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  蛋白質(zhì)是參與生命活動的重要物質(zhì),維持蛋白質(zhì)合成與降解的動態(tài)平衡是一切生命保持正常生理功能的必要條件。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解有兩條途徑,即溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑。其中泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是真核細胞、古細菌和其他一些細菌胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的通路之一。在真核細胞的細胞核和細胞漿中,80%以上的蛋白質(zhì),包括調(diào)控細胞周期、細胞程序性死亡以及感染等重要信號途徑的調(diào)節(jié)

2、蛋白均受此途徑的降解調(diào)控。蛋白酶體的主要功能是蛋白質(zhì)水解作用降解不需要的和損傷的蛋白質(zhì),其生化本質(zhì)就是通過水解蛋白質(zhì)的肽鍵,把大分子的蛋白質(zhì)水解為短肽片段,進而影響細胞的增殖、分化、凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)控制等。該通路的功能改變會引起蛋白質(zhì)降解的異常,進而導(dǎo)致細胞功能的異常。人體的許多疾病如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的發(fā)生與UPP功能異常密切相關(guān),因此UPP已經(jīng)成為多種疾病治療的新靶標。研究和開發(fā)干擾該途徑的藥物,為多種疾病的治

3、療提供了新的治療策略。
  目前抗腫瘤的主要策略包括烷化劑、抗代謝物和細胞毒藥物,以及與有絲分裂、拓撲異構(gòu)酶和酪氨酸激酶相關(guān)的抑制劑。金屬配合物在藥物設(shè)計和腫瘤治療中展現(xiàn)了獨特的性質(zhì),順鉑及其類似物作為睪丸癌和卵巢癌最有效的化療藥物應(yīng)用于臨床一線。但是其存在的毒性也促使新的高效低毒的藥物的開發(fā)。Q.Ping Dou等人報道銅的配合物具有抑制細胞26S蛋白酶體的功能,為蛋白酶體抑制劑的開發(fā)開辟了新途徑。
  研究目的:

4、  本研究前期實驗表明吡硫翁銅(Copper Pyrithione,CuPT)對細胞上26S蛋白酶體有明顯的活性,對純化的20S蛋白酶體則沒有抑制效應(yīng),提示CuPT可能作用于19S進而影響26S蛋白酶體活性的。進一步的研究表明CuPT對19S RP去泛素化酶USP14、Uch-L5和Rpn11(POH1)具有抑制效應(yīng)。因此如果將去泛素化酶CuPT和20S蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Velcade)聯(lián)合應(yīng)用將對腫瘤細胞的

5、泛素-蛋白酶體通路起到雙重抑制的效應(yīng),從發(fā)揮更好的抗腫瘤效應(yīng)。
  實驗方法:
  1、細胞活力測定:采用MTS法檢測去泛素化酶抑制劑CuPT聯(lián)合20S蛋白酶體抑制劑萬珂(Velcade,Vel)對腫瘤細胞活力的影響。
  2、細胞死亡檢測:采用AnnexinV-FITC/PI雙染熒光顯微鏡觀察并拍照記錄CuPT聯(lián)合Velcade(Vel)對細胞的形態(tài)學(xué)變化;同時用流式細胞儀分析細胞死亡情況。
  3、裸鼠載體實

6、驗:NCI-H929接種裸鼠兩側(cè)腋下,CuPT2.5mg.kg-1腹腔注射觀察并記錄給藥組和對照組裸鼠體重和腫瘤體積的變化,并在適當?shù)臅r候取材。
  4、特定蛋白檢測:采用 Western bolt檢測CuPT聯(lián)合 Velcade對蛋白酶體系統(tǒng)內(nèi)源性泛素化蛋白(Ub-proteins,Ub-pros.),泛素-蛋白酶體通路底物蛋白c-Jun、IκBα,細胞凋亡相關(guān)蛋白p27、Bax、pro-Caspase3、pro-Caspase

7、8、pro-Caspase9及PARP的影響。
  結(jié)果:
 ?。ㄒ唬〤uPT與Velcade聯(lián)合對腫瘤細胞的毒性、蛋白酶體泛素化底物及細胞死亡相關(guān)蛋白的變化
  1.CuPT與Velcade聯(lián)合對人骨髓瘤細胞 U266和人骨髓瘤NCI-H929的增值抑制效應(yīng)
  1.1細胞活力變化不同濃度的CuPT(12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM和400nM)與不同濃度的 Velcade(10nM、1

8、5nM、20nM、25nM和30nM)聯(lián)合作用于人骨髓瘤細胞U266和人骨髓瘤細胞NCI-H929細胞株24小時和48小時后MTS法檢測細胞活力明顯下降,作用優(yōu)于CuPT和Velcade的單獨用藥組,聯(lián)合指數(shù)小于1,表明 CuPT對 Velcade有增敏效應(yīng),并且這種效應(yīng)存在劑量依賴。
  1.2細胞死亡變化不同濃度的CuPT(25nM、50nM和100nM)與20nM的Velcade聯(lián)合作用于人骨髓瘤細胞NCI-H929細胞株1

9、8小時,AnnexinV-FITC/PI雙染熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)CuPT與Velcade聯(lián)合用藥組細胞死亡明顯多于CuPT單獨用藥組。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示CuPT單獨用藥組的細胞死亡率18小時分別為4%、4.3%和3.7%;CuPT與 Velcade聯(lián)合用藥組細胞死亡率18小時分別為34.5%、32.4%和30.7%。并且CuPT與Velcade聯(lián)合用藥組的細胞死亡以晚期凋亡和壞死為主。
 ?。ǘ┘毎核鼗孜镆约八劳鱿嚓P(guān)蛋白的變化

10、
  1.CuPT以及CuPT與Velcade聯(lián)合對人骨髓瘤細胞U266細胞株泛素化底物以及死亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
  不同濃度的CuPT(50nM、100nM、200nM和400nM)單獨用藥以及它們與20nM的Velcade聯(lián)合作用于人骨髓瘤細胞 U26618小時,Western Blot結(jié)果顯示不同濃度的CuPT單獨給藥時泛素化底物增加不明顯,只在400nM是有少許泛素化底物蛋白增加,而聯(lián)合用藥組泛素化底物蛋白明顯優(yōu)于Cu

11、PT單藥組;而且K48-聯(lián)接的多聚泛素化底物要明顯多于K63-聯(lián)接的多聚泛素化底物;同時CuPT400 nM以及CuPT和Velcade聯(lián)合用藥組均能增加泛素-蛋白酶體通路底物蛋白c-Jun。
  2.CuPT以及CuPT與Velcade聯(lián)合對人骨髓瘤細胞NCI-H929泛素化底物以及死亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
  不同濃度的CuPT(50nM、100nM和200nM)單獨用藥以及它們與20nM的Velcade聯(lián)合作用于人骨髓瘤細胞

12、NCI-H929細胞株18小時,Western Blot結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組能顯著增加泛素化底物,誘導(dǎo)pro-caspase3/8/9的減少,PARP裂解,轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax增加,介導(dǎo)腫瘤細胞死亡。
  3.CuPT以及CuPT與 Velcade聯(lián)合對人肝癌細胞 Hep G224小時泛素化底物以及死亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
  不同濃度的CuPT(50nM、100nM和200nM)單獨用藥以及

13、它們與20nM的Velcade聯(lián)合作用于人肝癌細胞Hep G224小時,Western Blot結(jié)果顯示Velcade組與聯(lián)合用藥組泛素化底物顯著增加,CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax增加,PARP裂解。
 ?。ㄈ〣SO和NAC對CuPT引發(fā)的總的泛素化底物以及 K48位聯(lián)接泛素化底物和K63聯(lián)接的泛素化底物的影響
  不同濃度的CuPT(0.25μM,0.5μM和0.75μM)作用兩小時后,分別加入100μM的

14、BSO和100μM的NAC。其中BSO可以增強CuPT的效應(yīng),而NAC則可以逆轉(zhuǎn)CuPT的效應(yīng)。
 ?。ㄋ模〤uPT對BALB/c裸鼠異種移植瘤的影響
  1.CuPT2.5mg/kg給藥五天,裸鼠體重的變化(圖12.A)腫瘤組織(圖12.B)以及對照組與用藥組平均瘤重對比(圖12.C),腫瘤生長抑制率為71.3%(p=0.001,<0.05),兩組之間存在顯著性差異。
  2.CuPT對裸鼠模型腫瘤組織相關(guān)蛋白的影響

15、:用藥組較對照組泛素化底物蛋白增加,CDI p27KIP1、促凋亡蛋白Bax、核因子IκBα、泛素-蛋白酶體通路底物蛋白c-Jun增加,PARP裂解。
  結(jié)論:
  1.CuPT作為去泛素化酶的抑制劑具有引起內(nèi)源性泛素化底物蛋白積累、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用,在與20S蛋白酶體抑制劑Velcade聯(lián)合應(yīng)用時,通過抑制泛素-蛋白酶體通路中不同的酶(19S RP去泛素化酶和20SCP水解酶活性)從而顯著增加腫瘤細胞死亡,增強Velc

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