融合蛋白PEP-1-vMIP-II的表達及其抗HIV-1功能研究.pdf

1、目的：原核表達細胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬細胞炎癥蛋白-Ⅱ（viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合蛋白pep-1-vMIP-II，并檢測該融合蛋白是否具有穿透細胞膜從而發(fā)揮激活多種抗HIV-1基因表達上調的功能。為vMIP-II發(fā)展成為一種新型的、易于給藥的防治艾滋病新藥提供基礎數據。
　　 方法：以KSHV基因組為模板，PCR擴增出vMIP-II的開放閱讀框。將化

2、學合成的細胞穿膜肽pep-1和vMIP-II基因克隆入原核表達載體pET15b，構建原核表達載體的pET15b-pep-1-vMIP-II質粒和對照載體pET15b-vMIP-II。重組質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3)plysS，IPTG誘導，SDS-PAGE和Western-blot鑒定表達產物，Ni-NTA瓊脂親和層析純化回收目的蛋白。分別取10μg/mL的融合蛋白pep-1-vMIP-II和不含穿膜肽序列的對照組蛋白vMIP-I

3、I處理Hela細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察該融合蛋白的穿膜功能。以200nmol/l的融合蛋白和對照蛋白同時分別處理HMEC-1細胞和Jurkat細胞，收集細胞，抽提總RNA，熒光定量PCR檢測抗HIV基因（MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F）的表達情況。
　　 結果：成功構建了原核表達載體pET15b-pep-1- vMIP-Ⅱ和pET15b-vMIP-II，DNA序列比對分析表明表達載體具有正確的序列

4、和閱讀框。表達并純化出可溶性pep-1- vMIP-Ⅱ融合蛋白及vMIP-Ⅱ蛋白。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示：融合蛋白pep-1-vMIP-II能穿透細胞膜進入細胞核內，vMIP-Ⅱ蛋白不能進入細胞核內。熒光定量PCR結果顯示：融合蛋白pep-1-vMIP-II能使Jurkat細胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分別上調3.36、2.21、1.40、2.09、2.72倍；使HMEC-1細胞抗H

5、IV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分別上調57.80、158.63、97.29、2.18、2.43倍。vMIP-II蛋白能使Jurkat細胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分別上調9.70、22.03、1.59、1.79、1.85倍；使HMEC-1細胞抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分別上調57.77、159.66、108