HIV-1融合蛋白gp41自然突變及功能研究.pdf

1、HIV包膜蛋白(Env)在病毒入侵過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用:介導(dǎo)受體結(jié)合和膜融合。研究表明，6-HB的形成是HIV膜融合的關(guān)鍵所在，而來(lái)自于NHR和CHR的多肽可以阻斷病毒6-HB的形成，是理想的藥物靶點(diǎn)?；谖覀?cè)趃p41上發(fā)現(xiàn)的新結(jié)構(gòu)M-T鉤子，我們以模板SC22EK設(shè)計(jì)了短小多肽MT-SC22，其具有極高的抑制活性，并且有很高的耐藥基因屏障。前期我們用模板短肽SC22EK及具有高抑制活性的MT-SC22篩選出在gp41保守序列上發(fā)生劇

2、烈的氨基酸突變的兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)(GIu49、Leu57)，分別簡(jiǎn)稱(chēng)為E49K、L57R。
　　本研究對(duì)HIV database Env序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在E49位點(diǎn)上出現(xiàn)由E突變?yōu)锳、D、G、K、N、Q、S共七種自然突變;在L57位點(diǎn)上共出現(xiàn)由L突變?yōu)镕、P、R、V四種自然突變。為了更全面地研究L57氨基酸位點(diǎn)的功能，本研究另外加入了L57A突變，一共12組氨基酸突變。本課題以表達(dá)HIV-1毒株NL4-3囊膜蛋白(Env)的質(zhì)粒

3、作為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功獲得了12個(gè)系列突變質(zhì)粒。經(jīng)Western Blot和capture ELISA檢測(cè)證實(shí)這些突變不影響Env的表達(dá)和切割;緊接著我們分析了突變對(duì)病毒入侵靶細(xì)胞能力以及膜融合抑制劑抗病毒活性的影響，發(fā)現(xiàn)多個(gè)自然突變能夠顯著影響HIV-1的入侵能力，并介導(dǎo)對(duì)抑制劑的高度耐藥;同時(shí)以NHR多肽N36為模板合成含有以上12種氨基酸突變的系列多肽，比較分析了N36、N36E49-X、N36L57-X對(duì)NL4-3假病毒株的

4、抑制活性以及多肽自身螺旋穩(wěn)定性，結(jié)果顯示突變后的氨基酸對(duì)NHR螺旋穩(wěn)定性、NHR螺旋三聚體與CHR親和性都有一定影響。我們從突變點(diǎn)對(duì)病毒囊膜蛋白功能、NHR穩(wěn)定性、6-HB穩(wěn)定性和抑制劑親和力四個(gè)主要方面，深入探討了HIV-1膜融合抑制劑的耐藥機(jī)制。
　　綜合多方面的研究結(jié)果，本研究得出以下結(jié)論:(1)E49和L57的突變毒株對(duì)短肽抑制劑（如SC22、HP23等）有較強(qiáng)的拮抗作用，而對(duì)長(zhǎng)肽類(lèi)抑制劑(如T20、SFT)的作用效果不明

5、顯;(2)病毒突變的氨基酸與CHR或抑制劑上相應(yīng)的氨基酸之間的電荷相互作用可以影響抑制劑的效率;另一方面，突變點(diǎn)可以影響病毒與抑制劑整體結(jié)合力;病毒突變后最終表現(xiàn)出的耐藥現(xiàn)象是此兩種因素共同影響下的一個(gè)平衡的結(jié)果;(3)病毒的入侵能力與耐藥性的高低基本符合“入侵能力越差耐藥倍數(shù)就越高”這一理論;(4)E49S/N/G三種突變對(duì)NHR螺旋穩(wěn)定性的影響是病毒耐藥性的主要影響因素;(5)E49A/Q/D三種突變后的氨基酸電荷對(duì)螺旋束整體穩(wěn)定性

6、的影響作用主導(dǎo)了病毒的耐藥表現(xiàn);(6)脯氨酸(P)屬于亞氨基酸，是α螺旋的破壞者，突變又處于NHR的核心區(qū)域，病毒發(fā)生L57P突變后完全喪失感染能力;(7)L57A/F/V三種突變，由于仍然保持了L57位點(diǎn)的疏水性，所以對(duì)短肽的活性影響比較溫和;(8)由于芳香族氨基酸F帶有的苯環(huán)形成空間位阻，減弱了NHR與抑制劑的親和力，所以L57F對(duì)C34和SFT呈現(xiàn)弱耐藥。本研究對(duì)HIV-1融合蛋白gp41的結(jié)構(gòu)與功能、gp41介導(dǎo)的病毒膜融合機(jī)制