黃荊子提取物VB1對人絨毛膜癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一章VB1對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的:
　　 探討VB1單藥和聯(lián)合5-FU用藥對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法:
　　 1.建立人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞培養(yǎng)體系。
　　 2.用細(xì)胞增殖抑制實驗(MTT法)檢測細(xì)胞增殖:VB1單藥:0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0，50.0μmol/L共7個濃度梯度，并選擇24，48，72h為3

2、個時間梯度;5-FU單藥:2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0，200.0μg/ml共7個濃度梯度，藥物作用時間48h;VB1聯(lián)合5-FU:將終濃度為5μmol/LVB1分別與不同濃度的5-FU共浴48h，對照組不加藥，檢測各組相對存活率，計算增殖抑制率。
　　 3.平板克隆形成實驗檢測不同藥物處理后各組的克隆形成率。
　　 4.不同藥物處理后，用Hoechst33258染色觀察凋亡形態(tài);流式細(xì)胞儀檢

3、測各組細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度的VB1(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μmol/L)分別作用JEG-3細(xì)胞后，結(jié)果顯示隨著VB1濃度和作用時間的增加，JEG-3細(xì)胞存活率減少（P＜0.05)。24h、48h、72小時的IC50分別為13.537、5.170、1.926μmol/L。
　　 2.48h時5-FU的IC50為25.257μg/ml，與5μmol/LV

4、B1合用時，IC50為4.078μg/ml，增效倍數(shù)為6.19倍。金氏公式計算q值均大于0.85，提示VB1與5-FU聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 3.不同濃度的VB1作用后，細(xì)胞的克隆形成率明顯低于對照組。藥物濃度越高，克隆形成率越低。VB1聯(lián)合5-FU用藥組的克隆形成率低于兩種藥物各自單獨(dú)用藥的克隆形成率(P＜0.05)。
　　 4.Hoehest33258染色觀察不同濃度的藥物作用JEG-3細(xì)胞后，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡

5、的多種形態(tài)改變;流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，各用藥組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組(P＜0.05)。VB1單獨(dú)作用JEG-3細(xì)胞，凋亡率與藥物的濃度正相關(guān)(P＜0.05)。VB1(5μmol/L)與5-FU(25μg/ml)聯(lián)合用藥組的凋亡率與相同濃度的單獨(dú)用藥組相比均明顯增高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.VB1在一定的濃度范圍內(nèi)，可以明顯抑制JEG-3絨癌細(xì)胞的增殖，作用效果是劑量-時間依賴的。
　　

6、2.VB1在一定的濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)JEG-3絨癌細(xì)胞的凋亡，呈劑量依賴性。
　　 3.VB1與5-FU合用對JEG-3絨癌細(xì)胞的抗腫瘤效果是協(xié)同增強(qiáng)的。
　　 第二章VB1對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制的研究
　　 目的:
　　 初步探討VB1對人絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3抑制增殖和促進(jìn)凋亡可能的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.RT-PCR檢測各濃度組AKT、mTOR、P

7、70S6K的mRNA的表達(dá)情況。
　　 2.Westernblot檢測各濃度組AKT、mTOR、P70S6K及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達(dá)情況。
　　 3.Westernblot檢測各濃度組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度VB1作用JEG-3細(xì)胞后AKT、mTOR、P70S6KmRNA的相對表達(dá)量均比對照組明顯降低;并且在一定程度上呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（P＜0.05）。
　　 2.W

8、esternblot結(jié)果顯示隨著VB1作用濃度的升高，JEG-3細(xì)胞的AKT、mTOR、P70S6K及相應(yīng)磷酸化蛋白的相對表達(dá)量均比對照組降低，不同濃度組各指標(biāo)差異均具有顯著性（P＜0.05）。
　　 3.隨著VB1作用濃度的升高，JEG-3細(xì)胞的pro-caspase-3的表達(dá)無明顯變化，而cleaved-caspase-3逐漸增強(qiáng)，Bcl-2的表達(dá)則逐漸減弱，與對照組比較，差別具有顯著性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論

9、:
　　 VB1對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞的抑制作用與mTOR信號通路相關(guān)，Caspase-3和Bcl-2家族的凋亡相關(guān)蛋白參與了VB1誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡的過程。
　　 第三章VB1對絨癌抗腫瘤作用的動物實驗研究
　　 目的:
　　 建立人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞SCID鼠移植瘤模型，研究VB1單獨(dú)及聯(lián)合5-FU對荷瘤小鼠移植瘤的作用，并初步觀察其毒副反應(yīng)。
　　 方法:
　　 1.建立

10、人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞SCID鼠移植瘤模型，觀察腫瘤模型的生物學(xué)特性。
　　 2.用VB1單獨(dú)及聯(lián)合5-FU作用荷瘤小鼠后，觀察測量小鼠腫瘤體積、重量的變化，檢測血清β-HCG水平的變化;并通過檢測血白細(xì)胞計數(shù)、骨髓涂片、肝酶變化、體重改變以了解其毒副反應(yīng)。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立人絨毛膜癌SCID小鼠移植瘤模型，移植瘤接種成功率為100％，成瘤均勻一致。
　　 2.VB1對人絨毛膜癌荷瘤SC

11、ID小鼠的的腫瘤生長有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，其體積抑瘤率、瘤重抑瘤率均明顯增加(P＜0.05)。VB1的高濃度組(80mg/kg)體積抑瘤率為76.65％，重量抑瘤率為46.56％。
　　 3.VB1聯(lián)合5-FU用藥組的體積抑瘤率和瘤重抑瘤率均比二者分別單獨(dú)作用時明顯增加(P＜0.05)，說明在動物模型體內(nèi)，VB1可增強(qiáng)5-FU的抑瘤作用。
　　 4.用藥后各組的血清β-HCG水平均明顯低于對照組，P＜0.

12、05。VB1用藥組β-HCG下降程度與藥物濃度正相關(guān)，聯(lián)合用藥組β-HCG水平低于兩藥單獨(dú)用藥組，具有顯著性差異，(P＜0.05)。
　　 5.各用藥組的外周血白細(xì)胞計數(shù)、血清ALT和AST結(jié)果與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，提示VB1短期內(nèi)對荷瘤小鼠的骨髓抑制作用、肝損害均不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.VB1對人絨毛膜癌JEG-3SCID小鼠皮下移植瘤的生長有明顯的抑制作用。
　　 2.VB