用DHPLC技術(shù)進(jìn)行單純性先天性心臟病易感基因SORBS2的突變分析.pdf

1、背景與目的:
　　 隨著現(xiàn)代社會科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及醫(yī)學(xué)模式的進(jìn)化，人類疾病譜和死亡譜已經(jīng)發(fā)生了很大改變，出生缺陷已逐漸成為我國嬰幼兒死亡的主要原因。先天性心臟病(CongenitalHeartDisease，CHD)是胎兒時(shí)期心血管發(fā)育異常而導(dǎo)致的先天畸形，是出生缺陷中最常見的類型，幾乎占據(jù)了主要出生缺陷的三分之一，在新生兒非感染性死亡中占首位。廣東省優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會2009年對廣東省0～5歲兒童出生缺陷情況調(diào)查結(jié)果顯示，先天性心

2、臟病是廣東地區(qū)最常見的出生缺陷，已成為嚴(yán)重影響兒童身心健康及人口生存質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生問題，給社會和家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神等方面的負(fù)擔(dān)。
　　 先天性心臟病中僅表現(xiàn)為心臟畸形而不伴有其他系統(tǒng)的先天異常，稱之為單純性先天性心臟病(non-syndromicCHD)，約占80％。隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近些年來的研究證實(shí)，該病是與環(huán)境因素相關(guān)的多基因遺傳病，其遺傳背景復(fù)雜，致病機(jī)制尚不明確，且其遺傳因素在疾病發(fā)生過程

3、中存在著明顯的地區(qū)差異和種族差異。由于發(fā)病率極高且患病后果嚴(yán)重，因此，研究該病的致病機(jī)制與易感基因試圖建立行之有效的疾病篩查和診斷技術(shù)可及早預(yù)防重型先天性心臟病患兒的出生，以期降低該病的發(fā)病率，不僅可以減少患兒家庭負(fù)擔(dān)，而且對提高我國人口素質(zhì)和人口質(zhì)量具有重要意義。
　　 心臟發(fā)育是胚胎發(fā)育過程中一個(gè)及其復(fù)雜的事件，許多基因按照時(shí)空順序的表達(dá)調(diào)控著心臟的正常發(fā)育，其中任何一個(gè)基因的異常都有可能導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。單純性CHD

4、的致病基因很多，它們之間存在相互影響和協(xié)同調(diào)節(jié)，在心臟發(fā)育的不同時(shí)期有著不同的表達(dá)與調(diào)節(jié)。并且與許多和機(jī)體生長發(fā)育、能量代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架以及細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、LIM蛋白、鋅指蛋白等相關(guān)的蛋白基因在心臟發(fā)育中相互協(xié)調(diào)、相互作用，形成有序的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因而，心臟并不是一個(gè)靜態(tài)的器官，將心臟的發(fā)育與身體其他器官分開來看是錯誤的;把兒童與成人的心臟疾患完全區(qū)分開也是有失公允的。心臟從開始發(fā)育，到最終成熟，再到成熟后的功能維護(hù)，是一個(gè)動態(tài)

5、的、整體的過程。
　　 目前，對先天性心臟病的研究分為四個(gè)方面:配體受體如NOTCH1、NODAL等;轉(zhuǎn)錄因子如GATA4、NKX2.5、TFAP2B等心臟發(fā)育早期的重要轉(zhuǎn)錄因子;收縮蛋白如MYH1、ACTC等，其他復(fù)雜基因如FLNA、ELN等。尤以轉(zhuǎn)錄因子的研究最多，涉及到其他遺傳學(xué)機(jī)制的分析報(bào)道較少，存在很大空白。心臟的發(fā)育涉及多種基因的相互調(diào)控與影響，而且與這些基因在不同時(shí)間和不同空間的先后表達(dá)和相互作用有關(guān)，其中任何基因

6、表達(dá)的質(zhì)或量的異常也可能會影響心臟的發(fā)育。在心臟表達(dá)的蛋白很多，其中銜接蛋白就屬于其中一類，而我們對于這一類蛋白在心臟中的表達(dá)調(diào)控功能還知之甚少。銜接蛋白由兩個(gè)或兩個(gè)以上的沒有酶活性的蛋白質(zhì)相互作用組成，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能。Vinexin，CAP/ponsin，與SORBS2(ArgBP2)構(gòu)成一個(gè)新的銜接蛋白家族，它們有與活性肽sorbin同源的SoHo保守區(qū)域，以及3個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域（Src同源3）。與該銜接蛋白家族相聯(lián)系的一部分蛋白已

7、經(jīng)確定。有越來越多的證據(jù)表明，該蛋白家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)增，遷移，黏附，凋亡，細(xì)胞骨架和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。其中的SORBS2蛋白在心臟大量表達(dá)，它的蛋白產(chǎn)物表達(dá)在心肌肌原纖維的Z帶中，對于裝配和維持心肌肌原纖維的穩(wěn)定性、附著性有重要作用。
　　 SORBS2又名ArgBP2，是一個(gè)70kD的在非肌肉細(xì)胞中表達(dá)于應(yīng)力纖維，在心臟表達(dá)于Z帶的蛋白質(zhì)。SORBS2定位于4q35.1，共有八種亞型，是通過不同剪接方式獲得的，分別由4

8、92到1100aa的氨基酸組成。其中大量表達(dá)于心臟的亞型1全長226794bp，cDNA為4939bp，編碼666個(gè)氨基酸，由23個(gè)外顯子，22個(gè)內(nèi)含子組成。
　　 SORBS2除了在心肌纖維的Z帶發(fā)揮作用之外，還有很多其他功能。通過羧基末端的SH3結(jié)構(gòu)域與非受體酪氨酸蛋白激酶家族成員c-Abl相互作用，通過氨基末端的SoHo同源結(jié)構(gòu)域與脂筏蛋白相互作用。由該蛋白在上皮和心肌亞細(xì)胞定位可知，其作為銜接蛋白在應(yīng)力纖維中裝配信號復(fù)合

9、體;在肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動性中發(fā)揮重要調(diào)控作用;在錨定連接中，與橋粒黏著斑蛋白協(xié)同作用;結(jié)合泛素連接酶Cbl，非受體酪氨酸激酶c-Abl可磷酸化Cbl，激活的Cbl可以促進(jìn)Abl的降解，發(fā)揮信號調(diào)節(jié)作用;或者與ATK1復(fù)合介導(dǎo)PAK1通路的激活;通過抑制細(xì)胞黏附，細(xì)胞遷移等作用抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
　　 SORBS2基因在細(xì)胞骨架的穩(wěn)定中有重要作用，作為支架蛋白，通過調(diào)節(jié)多種集中在細(xì)胞骨架的細(xì)胞信號通路控制細(xì)胞黏附和運(yùn)動的平

10、衡性。微管、微絲、中間絲及其結(jié)合蛋白構(gòu)成了心肌細(xì)胞的骨架系統(tǒng)，它們在維持心肌細(xì)胞正常形態(tài)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞等一系列生理活動中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞骨架成分將肌小節(jié)和細(xì)胞外基質(zhì)連接起來，構(gòu)成一個(gè)收縮力的傳導(dǎo)環(huán)路，起著傳導(dǎo)收縮力以及機(jī)械支撐的作用。心肌細(xì)胞骨架系統(tǒng)作為一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，不僅在維持心肌細(xì)胞形態(tài)，參與收縮活動中發(fā)揮作用，而且對心肌離子通道的錨定作用和功能方面有著重要的調(diào)控作用。細(xì)胞骨架變化往往會引起心肌缺氧、心肌肥厚及心力衰竭等

11、病理性進(jìn)程。細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白種類繁多，功能復(fù)雜，而銜接蛋白恰是其結(jié)合蛋白中的一種，其確切功能大部分還不清楚。研究細(xì)胞骨架，骨架結(jié)合蛋白及其與心肌離子通道的關(guān)系對于闡明多種心律失常的發(fā)生機(jī)制有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 因?yàn)樾呐K是一個(gè)動態(tài)的、整體的器官，大量不同種類的基因表達(dá)在其中，調(diào)控著心臟的正常發(fā)育與成熟，以及成熟后的功能維護(hù)。SORBS2作為銜接蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌肌原纖維的穩(wěn)定和細(xì)胞骨架調(diào)控等方面的作用，讓我們將之與心

12、臟的發(fā)育聯(lián)系起來，并且進(jìn)一步與先天性心臟病的形成聯(lián)系到一起。
　　 近年來，一種具有高效、精確、高通量、半自動化、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)的用于檢測已知突變及未知突變篩查，敏感性和特異性高達(dá)96％～100％的方法，變性高效液相色譜（DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC）技術(shù)被廣泛的應(yīng)用。與同樣是用于突變篩查的其他變異檢測技術(shù)相比，變性高效液相色譜有著明顯的優(yōu)勢。本研究主要是

13、通過定點(diǎn)誘變技術(shù)與基因克隆技術(shù)來構(gòu)建SORBS2基因的已知變異，并針對SORBS2基因的所有編碼區(qū)及剪接位點(diǎn)來設(shè)計(jì)變性高效液相色譜檢測方法，并用該檢測方法篩檢中國人群單純性先天性心臟病病例以期找到中國人SORBS2基因的相關(guān)數(shù)據(jù)。
　　 本研究旨在為進(jìn)一步研究單純性先天性心臟病分子機(jī)制，建立一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)且適于中國人群中國南方地區(qū)單純性先天性心臟病相關(guān)基因突變的研究方法，并為臨床上該類疾病的診斷、預(yù)防和治療提供參考，同時(shí)也

14、為SORBS2基因突變導(dǎo)致的其他銜接蛋白異常疾病的分子機(jī)制的研究提供借鑒和參考。
　　 材料與方法:
　　 1.標(biāo)本:共收集209例先天性心臟病病例（男性121例、女性84例、未知4例，年齡為0-6個(gè)月）和120例正常人的全血標(biāo)本，這些標(biāo)本大多來自于中山博愛醫(yī)院和珠江醫(yī)院等。采用標(biāo)準(zhǔn)的飽和酚/氯仿法從外周血中提取基因組DNA。
　　 2.分子分析方法:
　　 (1).針對NCBI數(shù)據(jù)庫中SORBS2的基因

15、變異采用大引物PCR方法定點(diǎn)誘變和基因克隆方法:首先通過設(shè)計(jì)定點(diǎn)誘變引物，采用PCR技術(shù)直接從人基因組DNA樣品中獲取目的基因——含某一變異的基因，然后運(yùn)用經(jīng)典的基因工程技術(shù)將其克隆至pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化的宿主菌為大腸桿菌DH5α。每個(gè)克隆重組子中插入的目的基因進(jìn)行DNA測序以驗(yàn)證基因變異型。
　　 (2).針對SORBS2基因的所有編碼區(qū)及剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)變性高效液相色譜分析的引物，構(gòu)建SORBS2基因的變性高效液相色譜分析方

16、法。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用建立的SORBS2基因變性高效液相色譜分析方法對構(gòu)建的包含SORBS2基因已知變異的人工變異體進(jìn)行穩(wěn)定性分析，確定該體系的穩(wěn)定性和可靠性。
　　 4.標(biāo)本篩檢:對所收集的標(biāo)本進(jìn)行SORBS2基因突變篩查。
　　 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析、總結(jié)。
　　 結(jié)果:
　　 運(yùn)用大引物PCR定點(diǎn)誘變方法人工構(gòu)建包含SORBS2基因已知變異的變異體，并將誘變得到的片段克隆到pMD2

17、0-T-載體后進(jìn)行測序，所有克隆均鑒定為所需變異，誘變成功率達(dá)100％。
　　 建立的針對SORBS2基因的變性高效液相色譜分析方法能夠快速、準(zhǔn)確地區(qū)分已知變異序列和野生型序列，并且靈敏性和穩(wěn)定性都好。
　　 收集209例單純性先天性心臟病和120例正常人標(biāo)本，對這些標(biāo)本進(jìn)行SORBS2基因的變性高效液相色譜分析檢測，未檢測到定點(diǎn)誘變的已知變異，也未發(fā)現(xiàn)新的致病突變，只檢測到4個(gè)已知的單核苷酸多態(tài)性(SNP)和兩個(gè)未報(bào)道

18、過的位于內(nèi)含子的基因變異。
　　 結(jié)論:
　　 變性高效液相色譜分析技術(shù)是近幾年來被廣泛應(yīng)用的基因突變檢測技術(shù)。這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無需序列特異性探針，無需純化，在PCR結(jié)束后直接進(jìn)行變性高效液相色譜檢測，即可完成對樣品基因型的分析。這種方法因其操作簡便、快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且靈敏度高而受到普遍的關(guān)注和廣泛應(yīng)用。
　　 本課題研究中建立的針對SORBS2基因的變性高效液相色譜分析檢

19、測方法能夠快速、準(zhǔn)確地將SORBS2基因變異序列與野生型序列區(qū)分，并且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和再現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高，體系可靠。本研究建立的基于PCR的變性高效液相色譜分析SORBS2基因突變方法是一種高通量、高靈敏度、半自動化、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的突變檢測技術(shù)。
　　 近年來，銜接蛋白家族的功能不斷被發(fā)掘，其中的SORBS2因在心臟中大量表達(dá)，而被考慮是否與先天性心臟病的形成相聯(lián)系，SORBS2基因的致病突變還未有被報(bào)道，也沒有對SORBS2

20、基因進(jìn)行人群突變篩查的研究。本研究中，利用變性高效液相色譜分析技術(shù)對中國人先天性心臟病病例標(biāo)本進(jìn)行突變篩查，沒有發(fā)現(xiàn)新致病突變，這也說明了中國人SORBS2基因突變的攜帶率相對較低。
　　 先天性心臟病作為一種與環(huán)境因素相關(guān)的多基因疾病，雖然已經(jīng)有超過40種基因被報(bào)道與先天性心臟病的形成有關(guān)，然而對于它的致病機(jī)理，我們?nèi)匀恢挥袦\顯而初步的認(rèn)識。已經(jīng)報(bào)道過的可能與先天性心臟病形成有關(guān)的致病基因中有很大一部分，都只在一些零星的散發(fā)病

21、例中被發(fā)現(xiàn)。
　　 目前，國內(nèi)外對先天性心臟病的病因分析主要認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄因子突變造成的，涉及到其他遺傳學(xué)病因分析的報(bào)道較少。根據(jù)PubMed等文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，未見有關(guān)中國人群SORBS2基因突變導(dǎo)致先天性心臟病的報(bào)道。因此本研究對先天性心臟病的遺傳學(xué)病因的研究具有重要的意義和價(jià)值。
　　 綜上所述，雖然SORBS2在心臟中大量表達(dá)，但其對單純性先天性心臟病的病因影響不大。我們猜測，SORBS2可能對心肌病變和細(xì)胞