TBX20基因在單純性先天性心臟病中的作用及其分子機制研究.pdf

1、目的：
　　先天性心臟病(Congenital Heart Disease，CHD)是一種常見的先天畸形，在新生兒中的發(fā)病率為1％～2％，占新生兒非感染性死亡的首位。其中約有80％僅表現(xiàn)為心臟畸形，而不伴有其它系統(tǒng)的先天異常，稱之為單純性先天性心臟病(simplecongenital heart disease)。臨床資料和流行病學研究表明，遺傳因素在CHD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，遺傳率為55％～65％，但其遺傳方式、外顯率等均

2、不清楚，致病基因尚未確定。
　　心臟發(fā)育是胚胎發(fā)育的早期事件，涉及到不同時間、不同空間相關分子的先后表達和相互作用。參與心臟發(fā)育的主要有四類分子:信號分子、細胞粘附分子、離子通道分子和轉(zhuǎn)錄因子，其中轉(zhuǎn)錄因子是現(xiàn)在研究最多的，如TBX5、TBX1、NKX2-5、GATA4、HAND1、TWIST、MEF2C等。這些轉(zhuǎn)錄因子之間通過DNA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成精確而復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，其中任一轉(zhuǎn)錄因子的改變都會影響正常的調(diào)控

3、網(wǎng)絡，引起心臟的異常發(fā)育而導致CHD發(fā)生。
　　TBX20(T-box20)基因?qū)儆赥-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員（TBX1亞家族），編碼一類具有T-box DNA結合域的轉(zhuǎn)錄因子，作為轉(zhuǎn)錄激活子或抑制子調(diào)控機體正常發(fā)育。動物實驗表明，Tbx20在心臟祖細胞、發(fā)育心肌以及心內(nèi)膜墊相關的內(nèi)皮細胞中表達，利用RNA干擾技術使Tbx20水平降低會導致心臟流出道和右室嚴重受損等心血管系統(tǒng)發(fā)育異常。在人類CHD患者中，研究人員已先后報道了TBX

4、20基因的錯義突變、無義突變和插入突變，提示TBX20基因是重要的CHD易感基因。
　　本課題組前期將單純性CHD易感基因初步定位于7p14-15，而TBX20基因正好位于此染色體區(qū)域內(nèi)。結合他人研究結果，我們認為:TBX20基因很可能是該染色體區(qū)域內(nèi)單純性CHD重要候選基因。因此，本研究首先選擇TBX20基因內(nèi)標簽單核苷酸多態(tài)性(tagSNP)進行SNP關聯(lián)分析;其次鑒定單純性CHD患者TBX20基因的突變或多態(tài)，并通過螢光素酶

5、報告系統(tǒng)、電泳泳動遷移實驗(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）等進行功能研究;最后檢測單純性CHD患者TBX20基因表達，并通過RNA干擾實驗闡明抑制TBX20基因表達對心肌細胞生物學特性的影響，為揭示TBX20基因在單純性CHD中的作用機制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　標本
　　本研究已收集的單純性CHD標本均已簽署知情同意書，并經(jīng)中國醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審查批準通過。
　　210個單純性CHD核心家系

6、、200例單純性CHD患者和200例正常對照由中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、盛京醫(yī)院和沈陽軍區(qū)總院提供。所有單純性CHD患者均具有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)心臟超聲和手術確診。
　　12例單純性CHD患兒及12例正常對照心肌組織標本由中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院和沈陽軍區(qū)總院提供。
　　1、TBX20基因SNP關聯(lián)分析
　　從HapMap數(shù)據(jù)庫選擇TBX20基因內(nèi)標簽SNP: rs336283，通過PCR-RFLP進行基因分型，應用ETD

7、T軟件進行關聯(lián)分析。
　　2、TBX20基因突變篩查
　　應用PCR結合DNA測序進行TBX20基因突變篩查。
　　3、c.-283G＞A多態(tài)與單純性CHD的關聯(lián)分析
　　通過PCR-RFLP進行c.-283G＞A多態(tài)基因分型，應用ETDT軟件和CLUMP軟件進行核心家系和病例-對照關聯(lián)分析。
　　4、c.-283G＞A多態(tài)對心肌組織TBX20基因表達的影響
　　應用RT-PCR和Western Bl

8、ot檢測心肌組織TBX20基因表達，并通過PCR-RFLP進行c.-283G＞A多態(tài)的基因分型。
　　5、c.-283G＞A多態(tài)對TBX20基因啟動子活性的影響
　　分別構建攜帶c.-283G＞A多態(tài)不同等位基因的TBX20基因啟動子螢光素酶報告載體，應用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析啟動子活性。
　　6、c.-283G＞A位點轉(zhuǎn)錄因子反應元件的鑒定
　　應用P-Match軟件，對TBX20基因啟動子區(qū)c.-283G＞A位

9、點附近序列進行預測，尋找潛在的轉(zhuǎn)錄因子反應元件。分別應用電泳泳動遷移實驗(EMSA)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)鑒定c.-283G＞A位點轉(zhuǎn)錄因子反應元件。
　　7、ZIC3對TBX20基因啟動子活性的影響
　　共轉(zhuǎn)染ZIC3表達載體pZIC3和攜帶c.-283G＞A多態(tài)不同等位基因的TBX20基因啟動子螢光素酶報告載體，應用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析啟動子活性。
　　8、ZIC3過表達和表達抑制
　　ZIC3表達載體

10、或ZIC3特異性siRNA轉(zhuǎn)染HEK293細胞，Real-time PCR檢測TBX20、BMP2和ISL1基因mRNA表達水平。
　　9、TBX20基因表達分析
　　應用RT-PCR和Western Blot檢測CHD患者心肌組織TBX20基因表達。
　　10、RNA干擾
　　大鼠Tbx20基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞H9c2，人TBX20基因特異性shRNA轉(zhuǎn)染人胚腎細胞HEK293，應用Real-t

11、ime PCR和Western Blot檢測靶基因表達。
　　11、干擾TBX20基因表達后心肌細胞生物學特性分析
　　采用CCK8活細胞染色法計數(shù)活細胞數(shù)，檢測細胞增殖;采用PI單染法測定細胞周期，應用Real-time PCR方法檢測細胞周期標志物Cyclin B1和P27基因mRNA表達;應用流式細胞術分析早期凋亡指標，TUNEL方法檢測晚期凋亡指標。
　　12、凋亡相關基因的鑒定
　　應用細胞凋亡PCR芯

12、片篩選凋亡相關基因，并通過Real-time PCR進行驗證。利用生物信息學軟件預測T-box結合位點，并應用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)驗證結合位點的存在。
　　13、TBX20基因表達抑制對心肌marker的影響
　　Real-time PCR方法檢測干擾TBX20基因表達后心肌marker GATA4和NKX2-5的表達。
　　結果：
　　1、TBX20基因與單純性CHD相關TBX20基因內(nèi)tagSNP關聯(lián)分

13、析顯示TBX20基因與單純性CHD相關(x2=5.17，P＜0.05)。
　　2、在TBX20基因啟動子鑒定了新的多態(tài)c.-283G＞A
　　雖然在單純性CHD患者外周血和心肌組織中并沒有發(fā)現(xiàn)TBX20基因的致病突變，但在TBX20基因啟動子鑒定了新的多態(tài)c.-283G＞A。病例-對照研究顯示A等位基因攜帶者患單純性CHD的風險高于G等位基因攜帶者(OR=1.745，95％ CI1.076～2.829，P=0.023)。核心

14、家系分析顯示A等位基因從正常雜合子雙親傳遞給患者后代的頻率遠大于預期值(x2=7.20，P=0.007)，提示A等位基因能夠增加單純性CHD患病風險。
　　3、c.-283G＞A多態(tài)影響心肌組織TBX20基因表達
　　GA型心肌組織內(nèi)TBX20基因表達明顯低于GG型心肌組織(P＜0.01)。
　　4、c.-283G＞A多態(tài)影響TBX20基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性
　　與pGL-283G相比，pGL-283A螢光素酶活性顯

15、著降低(P＜0.05)。
　　5、c.-283G＞A多態(tài)影響轉(zhuǎn)錄因子ZIC3結合親和力
　　生物信息學軟件預測，c.-283G＞A位點G→A的改變導致轉(zhuǎn)錄因子ZIC3結合位點消失。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和電泳泳動遷移實驗(EMSA)實驗分別在體內(nèi)、體外條件下鑒定了ZIC3與c.-283G型TBX20基因啟動子區(qū)的結合。
　　6、ZIC3劑量依賴性上調(diào)c.-283G型TBX20基因啟動子活性
　　pZIC3與p

16、GL-283G共轉(zhuǎn)染后螢光素酶活性上升(P＜0.01)，而pZIC3與pGL-283A共轉(zhuǎn)染后螢光素酶活性無變化。轉(zhuǎn)錄激活子ZIC3對c.-283G型TBX20基因啟動子活性的調(diào)控呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　7、ZIC3對TBX20基因的正調(diào)控是通過BMP2基因發(fā)揮作用
　　過表達ZIC3上調(diào)TBX20基因和BMP2基因表達（P＜0.05），對ISL1基因表達無影響;抑制ZIC3表達下調(diào)TBX20基因和BMP2基因表達(P＜0.0

17、5)，對ISL1基因表達無影響。
　　結論：
　　1、TBX20基因與單純性CHD相關。
　　2、TBX20基因突變可能不是TBX20基因參與單純性CHD發(fā)生的可能途徑。
　　3、TBX20基因啟動子區(qū)新的c.-283G＞A多態(tài)為功能性多態(tài)，通過影響轉(zhuǎn)錄因子ZIC3的結合親和力而降低TBX20基因表達，提高單純性CHD患病風險。
　　4、ZIC3是TBX20基因的轉(zhuǎn)錄激活子，以劑量依賴方式正調(diào)控TBX20基

18、因的表達，并通過TBX20-BMP2通路發(fā)揮作用。
　　5、TBX20基因在單純性CHD患者心肌組織的表達降低。
　　6、TBX20基因表達抑制能夠促進心肌細胞凋亡，抑制心肌細胞增殖，使細胞周期阻滯于G2期。
　　7、TBX20基因負調(diào)控促凋亡基因LTA表達，介導細胞凋亡的發(fā)生。
　　8、TBX20基因調(diào)控Cyclin B1基因和P27基因表達，參與心肌細胞增殖。
　　9、TBX20基因負調(diào)控心肌marke