漢坦病毒核蛋白重組克隆構(gòu)建及在梭菌栽體中的表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建含漢坦病毒截短核蛋白基因的重組質(zhì)粒，并在原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)氣莢膜梭菌中表達(dá)，為漢坦病毒鼠用口服疫苗的研制做好前期工作。 方法：以重組質(zhì)粒pGEX-4T-2/SA為模板，PCR擴(kuò)增漢坦病毒截短核蛋白基因片段。Ec081Ⅰ、BspT104 Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pJRC200，膠回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pJRC200-SA，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，菌液PCR、酶切、測序鑒定。將pJRC200-SA電穿孔

2、轉(zhuǎn)化產(chǎn)氣莢膜梭菌，先行厭氖增菌培養(yǎng)，后產(chǎn)芽孢培養(yǎng)誘導(dǎo)漢坦病毒截短核蛋白表達(dá)。超聲裂解產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢，對裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE、Western blot鑒定。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增獲得約580bp大小基因片段，與目的片段大小相符。菌液PCR得到約580bp大小基因片段，證明插入目的片段大小正確；Ec081Ⅰ、SalⅠ雙酶切得到8290bp和530bp兩基因片段，證明插入目的片段連接方向正確；Ec081Ⅰ、BspT104Ⅰ雙酶切

3、得到8240bp和580bp兩基因片段，證明目的片段插入位置正確：測序證明插入目的片段堿基序列正確，無堿基缺失和突變。SDS-PAGE顯示截短核蛋白有效表達(dá)，大小約27KDa。Western blot分析顯示該截短核蛋白能與腎綜合征出血熱病人陽性血清特異性結(jié)合。 結(jié)論：漢坦病毒截短核蛋白重組質(zhì)粒pJRC200-SA構(gòu)建成功。截短核蛋白能在原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)氣莢膜梭菌中有效表達(dá)，且具有良好的抗原性和特異性。為鼠用漢坦病毒口服疫苗的研制