埃博拉病毒核蛋白的表達(dá)及抗埃博拉病毒扎伊爾型核蛋白抗體的制備.pdf

1、埃博拉出血熱（Ebola hemorrhagic fever）是一種由埃博拉病毒(Ebola virus)引起的急性病毒性傳染病，是一種致死率很高的人獸共患病。最早于1976年在剛果(金)埃博拉河流域的蘇丹南部和扎伊爾地區(qū)首次爆發(fā)，導(dǎo)致多人死亡。由于到目前為止，此種出血熱并沒有十分有效的治療藥物及疫苗，且在我國境內(nèi)尚無此病癥出現(xiàn)，因此，建立有良好特異性的檢測方法顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出埃博拉病毒五種亞型的核蛋白，并

2、利用埃博拉病毒扎伊爾型核蛋白制備單克隆及多克隆抗體，為今后建立檢測方法奠定基礎(chǔ)。
　　 1.埃博拉病毒核蛋白的原核表達(dá)
　　 目的：通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得埃博拉病毒重組核蛋白。方法：將埃博拉病毒核蛋白基因亞克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28-(a)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28-(a)-EBOV-NP。重組質(zhì)粒鑒定正確后，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌，并利用終濃度為1mM/L的IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。蛋白成功表達(dá)后，將蛋

3、白利用His-Band Ni+柱進(jìn)行親和層析純化，然后通過Western blot 鑒定表達(dá)蛋白。結(jié)果：所構(gòu)建的重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物在經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定之后，得到與目的片段長度相同的特異性條帶，可初步確定重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒送樣測序后， 測序結(jié)果顯示與參考序列完全匹配沒有突變。純化后的蛋白經(jīng)10％SDS-PAGE 鑒定，出現(xiàn)與國外文獻(xiàn)報(bào)道大小相一致的特異性條帶。經(jīng)Westernblot 檢測，所表達(dá)的蛋白可以與抗埃博拉病毒

4、核蛋白多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。結(jié)論：所獲得的重組融合蛋白有很好的反應(yīng)原性。
　　 2.抗扎伊爾型埃博拉病毒核蛋白多克隆抗體及單克隆抗體的制備將純化后的扎伊爾型埃博拉病毒核蛋白免疫日本大耳白兔及大鼠，5次免疫后采用心臟采血法，獲得了抗埃博拉病毒扎伊爾型核蛋白的多克隆抗體。用間接ELISA 法檢測所得多克隆抗體的效價(jià)為：兔血清效價(jià)1：512000；大鼠血清效價(jià)1：128000。經(jīng)Western blot 檢測，所制多抗與埃博拉病毒

5、核蛋白有特異性反應(yīng)。將純化后的扎伊爾型埃博拉病毒核蛋白免疫BALB/c小鼠，首次免疫時采用每只小鼠50ug蛋白加同等體積福氏完全佐劑，皮下多點(diǎn)注射。此后3次免疫采用每只小鼠50ug蛋白加同等體積福氏不完全佐劑，皮下多點(diǎn)注射。共4次免疫后，于細(xì)胞融合前三天，采用每只小鼠50ug蛋白不加佐劑加強(qiáng)免疫。3天后細(xì)胞融合。然后采用間接ELISA 法篩選出陽性細(xì)胞株后，再用有限稀釋法對陽性細(xì)胞株進(jìn)行3次連續(xù)克隆后，最終獲得一株抗扎伊爾型埃博拉病毒核