帕金森病相關(guān)蛋白-Nurr1對(duì)酪氨酸羥化酶及p53轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控.pdf

1、帕金森病(PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，它是繼阿爾海默茲病的世界上第二常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，大約影響了60歲以上人口的百分之一。帕金森病表現(xiàn)為靜止性振顫，僵直，運(yùn)動(dòng)徐緩等臨床特征。PD主要的病理特征是中腦多巴胺能神經(jīng)元的喪失和路易小體的形成。但是，PD的確切病因卻仍然不清楚。目前已發(fā)現(xiàn)多種基因與PD的發(fā)生直接相關(guān)，其中一種就是Nurr1。 Nurr1是孤核受體家族成員之一，人們至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這類(lèi)家族成員相應(yīng)的配體。Nurr1

2、在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和存活過(guò)程中起著十分重要的作用。Nurr1序列的突變-291Tdel和-254T→G已在家族性PD病人中發(fā)現(xiàn)，并且這兩種突變體降低了酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)，這說(shuō)明Nurr1與PD的發(fā)生直接相關(guān)。Nurr1作為轉(zhuǎn)錄因子，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是它改變其轉(zhuǎn)錄活性的重要手段之一。最近，有文獻(xiàn)報(bào)道了Nurr1有抗凋亡功能，但具體機(jī)制不明。 本論文主要探討了Nurr1被ERK2磷酸化，并且磷酸化的Nurr1的轉(zhuǎn)錄活性

3、有所提高，導(dǎo)致TH的表達(dá)量升高；Nurr1通過(guò)與p53的結(jié)合，影響p53的轉(zhuǎn)錄活性，表現(xiàn)出促細(xì)胞存活的能力。主要研究結(jié)果如下： 1.我們運(yùn)用了體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀方法，發(fā)現(xiàn)Nurr1與ERK2在體外和細(xì)胞內(nèi)(二者蛋白共轉(zhuǎn)染)的情況下，這兩個(gè)蛋白可以結(jié)合。并且通過(guò)體外磷酸化的實(shí)驗(yàn)證明了Nurr1能夠被活化的ERK2磷酸化。我們制備了Nurr1的不同潛在ERK2結(jié)合結(jié)構(gòu)域的缺失突變體，通過(guò)進(jìn)一步的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，闡述了Nurr1序

4、列當(dāng)中與ERK2的結(jié)合位點(diǎn)。而且通過(guò)將Nurr1序列當(dāng)中的一共6個(gè)預(yù)測(cè)的ERK2的磷酸化位點(diǎn)的缺失或者點(diǎn)突變，進(jìn)行體外磷酸化的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Nurr1序列當(dāng)中的S126和T132為主要的磷酸化位點(diǎn)，T129和T185為次要的磷酸化位點(diǎn)。我們進(jìn)一步探討了被ERK2磷酸化的Nurr1的轉(zhuǎn)錄活性是否發(fā)生變化，我們通過(guò)報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了被ERK2磷酸化的Nurr1提高了Nurr1下游的TH的表達(dá)量，并且將Nurr1序列當(dāng)中的ERK2磷酸化位點(diǎn)

5、突變后，對(duì)TH的提高效應(yīng)就消失了。這些結(jié)果提示，Nurr1能夠被ERK2磷酸化，并且被ERK2磷酸化后的Nurr1的轉(zhuǎn)錄活性提高了。 2.我們通過(guò)過(guò)度表達(dá)Nurr1在不同的真核細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Nurr1能夠降低促凋亡基因Bax的表達(dá)，并且通過(guò)RNA干擾的手段將消減Nurr1在這些細(xì)胞中的表達(dá)，檢測(cè)到Bax的表達(dá)水平上升。由于Bax的表達(dá)量的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活，故而采取了MTT的方法來(lái)驗(yàn)證了過(guò)度表達(dá)Nurr1確實(shí)能夠提高細(xì)胞存活率，并

6、且在誘導(dǎo)凋亡藥物-阿霉素的刺激下，Nurr1仍然有著促細(xì)胞存活的功能。由于Bax是p53的靶基因，因而我們用體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證了Nurr1與p53之間的結(jié)合，我們又通過(guò)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了Nurr1能夠抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致了p53的下游靶基因的表達(dá)降低。我們運(yùn)用p53和Nurr1不同缺失突變體進(jìn)行了體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，找出了Nurr1的DBD和p53結(jié)合，p53的羧基端與Nurr1結(jié)合。接下來(lái)，我們進(jìn)一步探討了Nurr1

7、是如何影響p53的轉(zhuǎn)錄的。通過(guò)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Nurr1對(duì)p53的轉(zhuǎn)錄影響是依賴(lài)于這兩個(gè)蛋白的相互結(jié)合的；并且通過(guò)體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Nurr1與p53的結(jié)合影響了p53的低聚物的形成，最終導(dǎo)致了p53的轉(zhuǎn)錄活性的降低。 通過(guò)以上結(jié)果，我們闡述了Nurr1被ERK2的磷酸化修飾，提高TH的表達(dá)，以及Nurr1通過(guò)抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的其保護(hù)功能，這一發(fā)現(xiàn)可能為我們更好地了解帕金森病的發(fā)病機(jī)制，尋求治療帕金森病的方法