芍藥苷對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森模型保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分：芍藥苷對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的大鼠黒質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用
　　目的：建立6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠模型，研究芍藥苷（paeoniflorin，PF）和酸通道阻滯劑能否對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷起保護(hù)作用。
　　方法：選取雄性SD大鼠，立體定位儀下右側(cè)紋狀體予以注射10ug的6-OHDA（2ug/ul）制備PD模型。四周后觀察阿樸嗎啡（Apomorphine，APO）誘導(dǎo)的大鼠對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)行為。模型成功的PD大鼠分6組

2、，分別給予生理鹽水、PF（15mg/kg）、PF（30mg/kg）、PF（60mg/kg）、阿米洛利（Amiloride，Ami，10mg/kg）和狼蛛毒素（psalmotoxin-1，PCTX1，0.7ug/kg）連續(xù)治療21天，每周監(jiān)測(cè)APO誘導(dǎo)的大鼠對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)行為；給藥結(jié)束后，處死動(dòng)物，分離相應(yīng)的腦組織，免疫組化法尼氏染色觀察陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)，TH染色觀察黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量；采用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)損毀側(cè)大鼠紋狀體DA及代謝

3、產(chǎn)物DOPAC、HVA，5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA的含量；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）檢測(cè)損毀側(cè)D1R、D2R以及DAT的受體mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)各濃度的PF、特異性酸通道抑制劑PcTx1、非特異性酸通道抑制劑Ami均能改善6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)行為。(2)PD大鼠的未損毀側(cè)黒質(zhì)尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元與假手術(shù)組無(wú)差異。生理鹽水組損毀側(cè)黒質(zhì)尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元與假手術(shù)組相比，下降42.9％（**p<0.01）

4、。與生理鹽水組比較，各實(shí)驗(yàn)藥物治療組損毀側(cè)黒質(zhì)尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元有顯著增多（＃＃P<0.01）。(3)PD大鼠的未損毀側(cè)黒質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元與假手術(shù)組無(wú)差異。生理鹽水組損毀側(cè)黒質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元與假手術(shù)組相比，下降56.3%（**p<0.01）。與生理鹽水組比較，各實(shí)驗(yàn)藥物治療組損毀側(cè)黒質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元有顯著增多（＃＃P<0.01）。(4)PD大鼠的未損毀側(cè)紋狀體DA及代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA及DA代謝產(chǎn)物與DA之比與假手術(shù)組無(wú)差異。與假

5、手術(shù)組相比，生理鹽水組損毀側(cè)紋狀體DA下降72.1%，DOPAC下降50.3.%，HVA下降52.2%，DA代謝產(chǎn)物與DA之比上升46.8%（**p<0.01）。與生理鹽水組比較，各實(shí)驗(yàn)藥物治療組損毀側(cè)紋狀體DA及代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA含量顯著升高，DA代謝產(chǎn)物與DA之比顯著下降（＃＃p<0.01）。生理鹽水組損毀側(cè)紋狀體5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA的含量與假手術(shù)組相比無(wú)明顯差異，各實(shí)驗(yàn)藥物治療組與生理鹽水組相比亦無(wú)明顯差異。(

6、5)PD大鼠的未損毀側(cè)紋狀體D1R、D2R以及DAT的受體mRNA的表達(dá)水平與假手術(shù)組無(wú)差異。生理鹽水組損毀側(cè)紋狀體D1R、D2R以及DAT的受體mRNA的表達(dá)水平與假手術(shù)組相比下降明顯（**p<0.01）。與生理鹽水組比較，各實(shí)驗(yàn)藥物治療組損毀側(cè)紋狀體D1R、D2R以及DAT的受體mRNA的表達(dá)水平明顯升高（＃p<0.05，＃＃p<0.01）。
　　結(jié)論：通過(guò)腦立體定位注射6-OHDA可成功建立PD模型，PF和酸通道阻滯劑對(duì)黑質(zhì)

7、多巴胺神經(jīng)元損傷有明顯保護(hù)作用，對(duì)紋狀體多巴胺受體有一定調(diào)節(jié)作用。提示PF對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)與ASICs有關(guān)。
　　第二部分：芍藥苷對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和中腦原代神經(jīng)細(xì)胞損傷的的保護(hù)作用
　　目的：建立6-OHDA誘導(dǎo)的的細(xì)胞損傷模型，研究芍藥苷和酸通道阻滯劑能否改善6-OHDA對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）和原代培養(yǎng)的中腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷。
　　方法：體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞和胎鼠的中腦神經(jīng)細(xì)胞，預(yù)先加入無(wú)

8、菌生理鹽水、不同濃度PF（25，50，100uM）、PCTX1（2.5nM）和Ami（100uM）處理細(xì)胞1h，再加入6-OHDA（50uM）作用18h后，使用MTT法和LDH試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞的存活率和損傷程度；免疫熒光技術(shù)觀察中腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)TH的表達(dá)，對(duì)DA能神經(jīng)元純度進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：(1)與control組比較，生理鹽水組PC12細(xì)胞和中腦神經(jīng)細(xì)胞其存活率均明顯下降（**p<0.01），PC12細(xì)胞中下降約60%，中腦

9、神經(jīng)細(xì)胞中約50%，PF、PCTX1、Ami預(yù)處理組，存活率和生理鹽水組比有顯著上升（＃p<0.05，＃＃p<0.01）。(2)生理鹽水組 PC12細(xì)胞和中腦神經(jīng)細(xì)胞LDH值較對(duì)照組均明顯上升（**p<0.01），PC12細(xì)胞中上升約69%，中腦神經(jīng)細(xì)胞中約67%。與生理鹽水組比，PF、AM、PCTX1預(yù)處理組，LDH值有顯著下降（＃p<0.05，＃＃p<0.01）。(3)免疫熒光檢測(cè)，原代培養(yǎng)的中腦神經(jīng)細(xì)胞中DA能神經(jīng)元純度在7.56

10、±1.23%。
　　結(jié)論：PF和酸通道阻滯劑對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)損傷的的PC12細(xì)胞和原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，提示PF對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)與ASICs有關(guān)。
　　第三部分：芍藥苷對(duì)ASIC1a介導(dǎo)的α-syuclein自噬降解的調(diào)控作用
　　目的：研究PF和酸通道阻滯劑能否抑制敏感離子通道（Acid-sensing ion channels，ASICs），能否調(diào)控自噬并加速α-syuclein的降解。并探討

11、ASICs和自噬的關(guān)系，PF是否通過(guò)阻滯ASICs,尤其是ASIC1a來(lái)調(diào)控自噬發(fā)揮作用。
　　方法：以6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠和PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)免疫熒光和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)黑質(zhì)和PC12細(xì)胞α-synuclein、自噬相關(guān)蛋白（LC3-Ⅱ、p62）以及ASIC1a的蛋白表達(dá)變化；通過(guò)膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)PF是否能抑制酸處理后激發(fā)的電流。
　　結(jié)果：(1)在6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠模型中，與假手術(shù)組比較，生理鹽

12、水組損毀側(cè)黒質(zhì)DA能神經(jīng)元α-synuclein、LC－3 II、p62和ASIC1a蛋白水平顯著增加（**p<0.01）。與生理鹽水組比較，PF、PCTX1、Ami治療組α-synuclein、LC－3 II、P62、ASIC1a的蛋白水平均有不同程度下降（＃＃p<0.01）。(2)在6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞中，與control組比較，生理鹽水組α-synuclein、LC－3II、p62和ASIC1a蛋白水平顯著增加（**

13、p<0.01）， PF、PCTX1、Ami預(yù)處理后均能不同程度下調(diào)α-synuclein、LC－3II、P62、ASIC1a的蛋白水平（＃＃p<0.01）。(3)而且類似于PCTX1和Ami的作用，PF也對(duì)酸誘導(dǎo)的電流有一定抑制作用，且呈濃度依賴效應(yīng)。(4)免疫熒光也顯示了6-OHDA損毀側(cè)黒質(zhì)DA能神經(jīng)元和6-OHDA誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞上和TH共表達(dá)的ASIC1a表達(dá)增加。
　　結(jié)論：6-OHDA作用后，出現(xiàn)ASICs激活，