淫羊藿苷對魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠腦線粒體損傷所致帕金森病模型的保護(hù)作用.pdf

1、目的：觀察淫羊藿苷(icariin，ICA)對魚藤酮(rotenone，ROT)誘導(dǎo)的大鼠線粒體功能損傷的保護(hù)作用，并探討其可能存在的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：100只體重在220-250 g的SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、ICA空白給藥組、ROT(1 mg/kg/day)組、ICA低劑量組、ICA高劑量組。ROT采用背部皮下注射給藥， ICA采用灌胃給藥。具體為，ICA空白給藥組采用灌胃30 mg/kg/day的ICA以及背部皮下注射

2、0.2 mL/100 g溶媒（DMSO:生理鹽水=1:1），連續(xù)5周；ROT組采用背部皮下注射ROT(1 mg/kg/day)，同時灌胃0.5 mL/100 g的ddH2O，連續(xù)給藥5周；ICA低劑量組和 ICA高劑量組背部皮下注射 ROT(1 mg/kg/day)，同時分別灌胃ICA15和30 mg/kg/day，連續(xù)5周；空白組采用灌胃0.5 mL/100 g的ddH2O和背部皮下注射溶媒（DMSO:生理鹽水=1:1）。動物給藥結(jié)束

3、后，檢測行為學(xué)以及各類生化和分子生物學(xué)指標(biāo)。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)檢測行為學(xué)指標(biāo)。免疫組化酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）染色法檢測ICA對ROT誘導(dǎo)的多巴胺（dopamine， DA）能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。采用Oxygraph-2k線粒體呼吸功能儀，檢測各組動物線粒體呼吸功能。實(shí)時定量PCR（Real time-PCR，RT-PCR）法檢測皮質(zhì)PGC-1α、TFAM基因水平。Western blot法檢測大鼠皮質(zhì)、紋

4、狀體中α-突觸核蛋白（α-synuclein）的表達(dá)。Western blot法檢測大鼠皮質(zhì)、紋狀體中自噬相關(guān)蛋白：beclin-1、LC3-II、SQSTTM1/P62及自噬調(diào)控相關(guān)蛋白：mTOR、p-mTOR、P70 S6 Kinase、p-P70 S6 Kinase的表達(dá)。采用PC12細(xì)胞株進(jìn)一步研究ROT的細(xì)胞毒性及ICA的保護(hù)作用。細(xì)胞分為空白組、ROT（1μM）、ROT（1μM）+ICA（2μM）低劑量組、ROT（1μM）+

5、ICA（4μM）高劑量組，共4組。乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒檢測細(xì)胞毒性；Oxygraph-2k線粒體呼吸功能儀檢測各組細(xì)胞線粒體呼吸功能的差異；Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白:beclin-1、LC3-II、SQSTTM1/P62及自噬調(diào)控相關(guān)蛋白：mTOR、p-mTOR、P70 S6 Kinase、p-P70 S6 Kinase的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白

6、組比較，ROT模型組轉(zhuǎn)棒時間明顯減少，給藥ICA后顯著提高轉(zhuǎn)棒時間（P<0.05）。⑵免疫組化染色表明， ROT導(dǎo)致DA能神經(jīng)元數(shù)量減少，給藥ICA低、高劑量后DA能神經(jīng)元數(shù)量明顯增加（P<0.05）。⑶Oxygraph-2k線粒體呼吸功能結(jié)果顯示：與空白組相比，ROT組線粒體呼吸功能明顯下降（P<0.05）；與ROT模型組比較，ICA高劑量組線粒體呼吸功能顯著提升（P<0.05）。⑷RT-PCR結(jié)果顯示：與空白組相比，ROT組PGC-

7、1α和TFAM基因表達(dá)均顯著下降。其中，給藥ICA低、高劑量后，PGC-1α基因表達(dá)較ROT模型組均明顯上調(diào)；給藥ICA高劑量后，TFAM基因較ROT組明顯升高。⑸Western blot結(jié)果顯示：經(jīng)ROT作用，大鼠皮質(zhì)和紋狀體中α-synuclein蛋白表達(dá)明顯升高；ICA低、高劑量組與 ROT模型比較，α-synuclein蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。進(jìn)一步，ROT導(dǎo)致自噬及相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)改變。結(jié)果顯示，ROT導(dǎo)致皮質(zhì)和紋狀體中beclin

8、-1和LC3-II蛋白表達(dá)水平下降，同時P62，p-mTOR，p-P70表達(dá)升高，表明自噬通路被抑制，而ICA給藥明顯激活LC3-II和beclin-1蛋白表達(dá)，同時降低P62，p-mTOR，p-P70蛋白水平，改善ROT誘導(dǎo)的自噬通路的抑制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，ROT導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)LDH釋放顯著升高，線粒體呼吸功能被抑制，自噬被抑制；與ROT組比較，ICA能顯著降低LDH的釋放，保護(hù)線粒體呼吸功能及改善自噬過程的抑制。
　　結(jié)