G6PD-6PGD酶活性直接比值法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化探討.pdf

1、紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是人類最常見的遺傳性酶缺陷病，呈X染色體連鎖不完全顯性方式遺傳，全世界約有2-4億人受累，我國(guó)分布呈“南高北低”的趨勢(shì)?；颊吲R床表現(xiàn)變化大，從無(wú)癥狀到新生兒黃疸、藥物或感染造成的急性溶血、蠶豆病和重癥慢性非球形紅細(xì)胞溶血性貧血（CNSHA），嚴(yán)重者導(dǎo)致新生兒期重癥核黃疸，造成死亡或永久性神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。該病的及早診斷和預(yù)防是我國(guó)優(yōu)生優(yōu)育工作的一個(gè)重要組成部分，檢測(cè)是否存在G6PD缺乏，給患者

2、合理的忠告，避免使用可能引起溶血的藥物，合適處理由此引起的新生兒高膽紅素血癥，是該病的重點(diǎn)。 G6PD缺乏癥的分子基礎(chǔ)是基因突變，G6PD基因位于Xq28，由13個(gè)外顯子及12個(gè)內(nèi)含子組成，全長(zhǎng)20kb，是一典型的看家基因。隨著G6PD基因結(jié)構(gòu)的闡明和分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，新的突變類型被不斷發(fā)現(xiàn)。迄今世界上已報(bào)道140多種，G6PD基因突變具有以下特點(diǎn)：多為單個(gè)堿基置換的錯(cuò)義突變；大多數(shù)基因突變屬于轉(zhuǎn)化型突變，常發(fā)生在CpG二核

3、苷酸內(nèi)的C-T的轉(zhuǎn)換；具有種族和地區(qū)異質(zhì)性；尚未發(fā)現(xiàn)整個(gè)基因或大片段基因的缺失，也未見無(wú)義突變及移碼突變；除外顯子Ⅰ外，基因突變遍及其余外顯子；具有復(fù)合突變。 迄今為止，在中國(guó)人中共發(fā)現(xiàn)17種G6PD基因突變類型。它們分別是：A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C592T、A835G、A835T、G87lA、C1004T、C1024T、G1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1

4、388A。不同地區(qū)人群基因突變類型和發(fā)生頻率不同，同一地區(qū)不同民族基因突變類型也不同。資料表明，G6PD基因外顯子上的G1376T和G1388A是中國(guó)人群G6PD缺乏者最常見的基因突變類型，其次為A95G和C1024T。在南方地區(qū)，如廣東、廣西、海南省G1376T、G1388A、A95G這三種突變占75.6％以上，G392T、C592T、G871A、C1024T這四種突變占10％-20％左右，其他稀少突變和未知突變占20％，因此G6PD

5、缺乏在特定地區(qū)有熱點(diǎn)突變類型，同時(shí)尚有相當(dāng)比例的基因突變未被發(fā)現(xiàn)。 常規(guī)的基因診斷方法，如等位基因特異性擴(kuò)增（ARMS），錯(cuò)配堿基聚合酶鏈反應(yīng)/限制內(nèi)切酶圖譜分析（miswatch-PCR/RE）、等位基因寡核苷酸探針雜交（ASO）等方法用于檢測(cè)已知突變，聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）、變性梯度凝膠電冰（DGGE）、溫度梯度凝膠電冰（TGGE）等方法用于檢測(cè)未知突變。但均存在檢測(cè)效率低、漏檢率高，不能確定基

6、因型等不足。 變性高效液相色譜（DHPLC）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的核苷酸檢測(cè)技術(shù)，是分離核苷酸片段及分析檢測(cè)已知基因突變核單核苷酸多肽性（SNP）的最佳技術(shù)，為檢測(cè)突變和SNP提供新的檢測(cè)平臺(tái)，DHPLC可以高通量、敏感而準(zhǔn)確地檢測(cè)已知DNA變異、發(fā)現(xiàn)新突變或多態(tài)性，自動(dòng)化程度高，檢測(cè)結(jié)果以圖表顯示，直觀易判斷，但技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)，只用于科學(xué)研究，目前尚難以在臨床醫(yī)院推廣使用。 目前檢測(cè)G6PD缺乏癥常用的

7、篩查方法有:①高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)法（MHBRT），該方法優(yōu)點(diǎn)在于不需要昂貴的試劑或儀器，操作簡(jiǎn)單，可用于普查,但存在假陽(yáng)性；②熒光斑點(diǎn)法，該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，假陽(yáng)性低，缺點(diǎn)是需長(zhǎng)波紫外光燈及氧化型谷胱甘肽（GSSG），判斷結(jié)果受主觀因素影響大；③硝基四氮唑藍(lán)法（NBT），該方法只需使用普通的可見光光度計(jì)且試劑用量少；④高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)微量組織化學(xué)洗脫法（MHBRT），該方法優(yōu)點(diǎn)是對(duì)雜合子的檢出率特別有效，但作為篩查法則過(guò)于繁瑣

8、，不適于臨床常規(guī)使用。前三種方法對(duì)于G6PD正常、女性純合子、男性半合子的靈敏度和特異度均很高，但對(duì)于女性雜合子檢出率較低，分別為50％，30％，40％。即使是目前國(guó)際公認(rèn)的G6PD缺乏癥的確診方法——G6PD/6PGD酶活性直接比值法（UVST）對(duì)于女性雜合子檢出率也只有69.1％。能否通過(guò)改良優(yōu)化現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法提高對(duì)G6PD缺乏癥尤其是女性雜合子的檢出率進(jìn)而提高對(duì)G6PD診斷的靈敏度呢?鑒于目前國(guó)內(nèi)外少有對(duì)于該方面的研究，嘗試性對(duì)目前

9、國(guó)際公認(rèn)的G6PD/6PGD酶活性直接比值法進(jìn)行了試探性的改良優(yōu)化和對(duì)比試驗(yàn)研究，并獲得了可喜的結(jié)果。 目的:探討采用不同的取樣方法對(duì)國(guó)際公認(rèn)的G6PD/6PGD比值法進(jìn)行改良優(yōu)化，并分別把兩種改良方法（分別命名為改良方法B、改良方法C）與現(xiàn)用常規(guī)方法（方法A）對(duì)雜合子的檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比研究，進(jìn)而對(duì)改良方案做出評(píng)價(jià)，以提高女性G6PD雜合子的檢出率，減少漏診。 方法:從廣東省人民醫(yī)院病房和門診送檢的G6PD標(biāo)本中抽取200例

10、，每份標(biāo)本分別用國(guó)際公認(rèn)的G6PD/6PGD比值法以及兩種改良的G6PD/6PGD比值法進(jìn)行檢測(cè)，雙盲法與PE/DHPLC診斷結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，分析兩種改良方法與常規(guī)方法對(duì)G6PD缺乏癥檢測(cè)結(jié)果及診斷結(jié)果的差異、符合率，總結(jié)三種方法對(duì)G6PD缺乏癥雜合子的檢出率。 結(jié)果:改良方法B的G6PD/6PGD比值、對(duì)疾病的診斷與常規(guī)方法A存在顯著差異，靈敏度較常規(guī)方法A高；改良方法C的G6PD/6PGD比值、對(duì)疾病的診斷與常規(guī)方法A存在顯著

11、差異（t=17.141，p<0.05），靈敏度亦較常規(guī)方法A高。PE/DHPLC檢測(cè)（特別是家系調(diào)查）結(jié)果表明改良方法C對(duì)女性雜合子的檢出率為98％，常規(guī)方法A對(duì)女性雜合子的檢出率為79.5％，改良方法B為92.0％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：改良方法C對(duì)于雜合子的檢出率高于常規(guī)方法A與改良方法B。 結(jié)論：對(duì)國(guó)際公認(rèn)的G6PD/6PGD比值法進(jìn)行改良的方法C（以成熟紅細(xì)胞加蒸餾水溶血）可提高G6PD女性雜合子的檢出率，有望成為解決G6PD女