未成熟卵體外成熟技術(shù)對小鼠腎臟腎素—血管緊張素系統(tǒng)基因表達和甲基化修飾的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:研究IVM小鼠腎臟RAS系統(tǒng)基因如Agt、Ace、Ren1、Ren2、Agtr-1a、Agtr-1b、Ace2、Agtr2和微小RNAs(Micro-RNA,MiRNAs)的表達、以及Agt和Ace的甲基化狀況,闡明IVM對出生小鼠血壓調(diào)控相關(guān)機制的影響。
  材料和方法:
  1.利用C57BL/6J小鼠,通過單純注射孕馬血清獲取未成熟卵,經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、ICSI輔助受精和胚胎移植等方法建立IVM小鼠模型。通過注射孕

2、馬血清和人絨毛膜促性腺激素獲取成熟卵,經(jīng)ICSI輔助受精和胚胎移植等方法建立體內(nèi)成熟小鼠模型(CON),出生小鼠飼養(yǎng)至10周及1.5年時,分別處死獲取兩組小鼠的腎臟組織。
  2.通過熒光定量PCR技術(shù),檢測10周及1.5年兩組小鼠腎臟組織RAS基因如Agt、Ace、Ren1、Ren2、Agtr-1a、Agtr-1b、Ace2、Agtr2和miRNAs(miRNA698,miRNA27a,miRNA155和miRNA143)的表達

3、。
  3.利用焦磷酸測序技術(shù)檢測兩組小鼠兩個時期腎臟組織Agt和Ace的各位點的甲基化情況。
  4.通過western-blot技術(shù),檢測兩組小鼠兩個時期腎臟組織AGT、ACE、ACE2和AGTR1蛋白的表達。
  結(jié)果:
  1.IVM對出生后子代腎臟組織RAS系統(tǒng)各基因表達的影響
  (1)10周,兩組小鼠腎臟組織RAS系統(tǒng)各基因表達分析
  10周時,與體內(nèi)成熟小鼠相比,IVM小鼠腎臟組織A

4、gt、Ace、Ren1、Ren2和Agtr-1b表達水平顯著升高,Agtr-1a和Ace2表達水平顯著下降,而Agtr-2的表達差異無統(tǒng)計學意義。同時,IVM小鼠腎臟組織miRNA-698、miRNA-27a和miRNA-155的表達較體內(nèi)成熟小鼠顯著性增高;但兩組間的miRNA-143的表達差異無統(tǒng)計學意義。
  (2)1.5年,兩組小鼠腎臟組織RAS系統(tǒng)各基因表達分析
  1.5年時,與體內(nèi)成熟小鼠相比,IVM小鼠腎臟組

5、織Agt和Ace表達水平顯著升高,Ren1、Agtr-1a、Agtr-1、Ace2和Agtr-2表達水平顯著下降,而Ren2的表達差異無統(tǒng)計學意義。同時,IVM小鼠腎臟組織miRNA-698、miRNA-27a和miRNA-143的表達較體內(nèi)成熟小鼠顯著增高,miRNA-155表達顯著降低。
  2.IVM對出生后子代腎臟Agt和Ace甲基化修飾影響
  依據(jù)上述Agt及Ace的長期表達差異,選取Agt的3個甲基化位點和Ac

6、e的4個甲基化位點進行焦磷酸測序。
  (1)10周兩組小鼠腎臟組織Agt和Ace的甲基化狀態(tài)分析
  10周時,相較于體內(nèi)成熟小鼠之間,IVM小鼠腎臟組織Agt的CpG2位點甲基化率顯著性降低,Ace的CpG1和CpG2位點甲基化率顯著性升高。而兩組小鼠腎臟組織Agt及Ace其他CpG位點甲基化狀態(tài)無統(tǒng)計學差異。
  (2)1.5年兩組小鼠腎臟組織Agt和Ace的甲基化狀態(tài)分析
  1.5年,IVM小鼠腎臟組織

7、Ace的CpG1甲基化率低于體內(nèi)成熟小鼠,差異具有統(tǒng)計學意義。而兩組小鼠腎臟組織Agt和Ace其他CpG位點的甲基化狀態(tài)沒有統(tǒng)計學差異。
  3.IVM對出生后子代腎臟組織AGT、ACE、ACE2和AGTR-1蛋白表達的影響
  相較于體內(nèi)成熟組,10周IVM小鼠腎臟組織AGT蛋白表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義,但到1.5年時,IVM小鼠腎臟組織AGT蛋白表達水平增高,差異具有統(tǒng)計學意義。而在10w和1.5y兩個時間段,兩組

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