液氦玻璃化冷凍對(duì)牛未成熟卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、未成熟卵母細(xì)胞低溫保存對(duì)動(dòng)物種質(zhì)資源的保護(hù)有重要意義。雖然有些成功的報(bào)道，但因冷凍過程中造成的結(jié)構(gòu)和功能損傷，使其發(fā)育能力仍不理想。為此，我們建立了一種以液氦（LHe，﹣269℃）為冷源進(jìn)行玻璃化冷凍牛未成熟卵母細(xì)胞的方法。目前的研究表明：液氦玻璃化冷凍法在提高冷凍速率的同時(shí)，也降低了冷凍保護(hù)劑的濃度。然而，該方法是否會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因表達(dá)造成損傷還不清楚。本研究的目的是探討液氦OPS玻璃化冷凍對(duì)牛未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育能力、

2、超微結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因表達(dá)的影響。以下研究，均以牛未成熟的卵母細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，隨機(jī)分為新鮮組（ Control組，陰性對(duì)照）、液氮冷凍處理組（LN組，陽性對(duì)照）和液氦處理組（LHe組）。
　　實(shí)驗(yàn)1：液氦玻璃化冷凍對(duì)牛未成熟卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響。液氦玻璃化冷凍牛未成熟卵母細(xì)胞，然后將其解凍并進(jìn)行體外培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)其形態(tài)正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率等發(fā)育指標(biāo)變化，分析液氦冷凍的效果。液氦組的各項(xiàng)發(fā)育指標(biāo)（87.1％、51%、41.7

3、%和13%）顯著高于液氮組（80.5%、48%、36.8%和8.5%， P＜0.05），但冷凍組的發(fā)育能力均低于新鮮對(duì)照組（100%、73.2%、62%和39.8%，P＜0.05）。結(jié)果表明，液氦冷凍牛未成熟卵母細(xì)胞的方法，改善了冷凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。
　　實(shí)驗(yàn)2：液氦玻璃化冷凍對(duì)牛未成熟卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。借助透射電子顯微鏡設(shè)備，觀察液氦玻璃化冷凍牛未成熟卵母細(xì)胞后，其透明帶、線粒體、皮質(zhì)顆粒和脂滴等超微結(jié)構(gòu)的變化。液氦

4、組卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷明顯小于液氮處理組，表現(xiàn)在線粒體的數(shù)量與完整度、皮質(zhì)顆粒的數(shù)量與分布以及脂滴含量較少等方面。但兩個(gè)冷凍組明顯不如對(duì)照組的結(jié)構(gòu)清晰而完整，主要表現(xiàn)為卵周隙和微絨毛基本消失、細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)密度小而模糊及線粒體不同程度的退化等方面。這些結(jié)果說明，液氦冷凍牛未成熟卵母細(xì)胞的過程降低了液氮對(duì)其超微結(jié)構(gòu)的損傷程度。
　　實(shí)驗(yàn)3：液氦玻璃化冷凍對(duì)牛未成熟卵母細(xì)胞體相關(guān)基因表達(dá)的影響。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)液氦玻璃化

5、冷凍牛未成熟卵母細(xì)胞后，卵母細(xì)胞內(nèi)P53、CDC20、Eg5和Npm2等與發(fā)育相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的變化。P53和Eg5兩個(gè)基因，在液氮組中的表達(dá)水平顯著高于液氦組和對(duì)照組（P＜0.05），且P53基因在液氦組和對(duì)照組之間差異不顯著（P＞0.05）。液氮組和液氦組的CDC20基因表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），但兩者均顯著低于對(duì)照組。Npm2基因在液氦組的表達(dá)量低于對(duì)照組（ P＜0.05），但液氮組和對(duì)照組之間差異不顯著（ P＞0.