TGF-β1誘導食管鱗狀細胞癌細胞TE13發(fā)生上皮間質轉化及其參與放射抗性的分子機制.pdf

1、目的:以體外培養(yǎng)的食管鱗狀細胞癌細胞株TE13為實驗對象，通過放射線反復照射篩選出的具有EMT樣表型的放射抗性細胞株TE13R120，并利用轉化生長因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）誘導TE13細胞發(fā)生上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，建立EMT細胞模型。對TE13細胞株、EMT模型細胞和TE13R120細胞進行Real-Tim

2、e PCR、Western blot、免疫細胞化學檢測，測定這三株細胞株中神經營養(yǎng)因子受體（neurotrophin receptor p75 interacting MAGEhomologue，NRAGE）基因的表達和細胞內定位情況。探討食管癌細胞中NRAGE亞細胞定位在EMT與放射抗性形成中的作用，對深入研究食管癌細胞的惡性生物學行為具有重要意義，為放射抗性造成的放療失敗提供一種新的思路和實驗依據，同時也為腫瘤治療提供了新的靶點。<

3、br>　　方法:人食管鱗狀細胞癌細胞株TE13常規(guī)培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。實驗分為三組:TE13細胞組、EMT細胞模型組、TE13R120細胞組，通過Real-Time PCR、Western blot和免疫細胞化學三種實驗技術分別檢測NRAGE的mRNA表達情況及總蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白的表達情況。其中TE13R120細胞株經過放射線反復照射篩選TE13累積劑量120Gy所得，通過細胞克隆形成實驗驗證其放射抗性。并通過

4、倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變，通過Western blot、Real-Time PCR檢測EMT相關標志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達和mRNA表達情況驗證EMT樣表型的存在。EMT細胞模型利用TGF-β1誘導TE13細胞株所得，并通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變，Western blot、Real-TimePCR檢測EMT相關標志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達和mRNA表達情況驗證是否誘導成功。

5、統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件包進行數(shù)據分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05即認為有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.建立放射抗性細胞株TE13R120，并驗證其放射抗性及存在EMT樣表型
　　建立TE13R120細胞后，進行克隆形成實驗擬合細胞存活曲線，計算TE13及TE13R120細胞放射敏感性參數(shù)D0、Dq、N值和SF2，TE13細胞分別為:2.242、0.854、

6、1.465、0.538;TE13R120細胞分別為:2.499、1.991、2.219、0.734。
　　倒置顯微鏡下觀察對數(shù)生長期的單層細胞TE13細胞株和TE13R120細胞株形態(tài)學差異，TE13細胞株為不規(guī)則的多邊形，細胞間邊界不清，呈片狀生長;而TE13R120細胞株則細長呈梭行或紡錘形，細胞極性消失。Western blot檢測EMT相關標志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達情況，TE13細胞組的E-ca

7、dherin表達（403.526±32.684）高于TE13R120細胞組（132.291±6.542）(P＜0.05);TE13細胞組的Vimentin表達（86.438±4.387）低于TE13R120細胞組（400.324±5.698）(P＜0.05)。Real-Time PCR檢測EMT相關標志物E-cadherin、Vimentin的mRNA表達情況。TE13細胞組的E-cadherin表達（1.576±0.290）高于TE1

8、3R120細胞組（0.095±0.052）(P＜0.05);TE13細胞組的Vimentin表達(1.015±0.236)低于TE13R120細胞組（23.145±1.131）（P＜0.05）。
　　2.TGF-β1誘導食管鱗狀細胞癌細胞株TE13細胞發(fā)生EMT
　　取對數(shù)生長期的單層細胞于倒置顯微鏡下觀察，TGF-β1(10ng/ml)刺激TE13細胞株48h后發(fā)生的形態(tài)學改變，細胞由不規(guī)則的多邊形轉變?yōu)榧忓N形;細胞間的結

9、合由緊密變?yōu)槭杷伞estern blot檢測EMT相關標志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達情況，TE13細胞組的E-cadherin表達（403.526±32.684）高于EMT細胞模型組（156.369±5.722）(P＜0.05);TE13細胞組的Vimentin表達（86.438±4.387）低于EMT細胞模型組（389.324±9.378）(P＜0.05)。Real-Time PCR檢測EMT相關標志物E-c

10、adherin、Vimentin的mRNA表達情況。TE13細胞組的E-cadherin表達（1.576±0.290）高于EMT細胞模型組（0.213±0.142）(P＜0.05); TE13細胞組的Vimentin表達（1.015±0.236）低于EMT細胞模型組(22.848±0.211)(P＜0.05)。
　　3.NRAGE在三組細胞中的表達情況
　　通過Real-Time PCR、Western blot、免疫細胞化

11、學技術對NRAGE在TE13細胞組、EMT細胞模型組、TE13R120細胞組中的表達情況進行檢測。Real-Time PCR檢測NRAGE的mRNA表達情況，TE13細胞組（1.6826±0.749）分別低于EMT細胞模型組(5.253±0.916)(P＜0.05)和TE13R120細胞組（5.562±2.212）(P＜0.05);EMT細胞模型組與TE13R120細胞組之間無差別(P＞0.05)。Western blot檢測NRAGE

12、的蛋白表達情況，TE13細胞組(34.408±3.267)分別低于EMT細胞模型組（160.327±15.797）（P＜0.05）和TE13R120細胞組(163.472±13.583)(P＜0.05);EMT細胞模型組與TE13R120細胞組之間無差別(P＞0.05)。進一步運用Western blot檢測NRAGE在胞漿和胞核中蛋白表達情況。通過對三組細胞胞漿中NRAGE蛋白表達情況進行兩兩比較，三者比較均無差別(P(TE13 VS

13、.EMT)＞0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＞0.05、P(TE13R120 VS.EMT)＞0.05);兩兩比較在胞核中表達情況是否存在差別:TE13細胞組（45.384±3.680）分別低于EMT細胞模型組（198.345±26.265）和TE13R120細胞組（210.589±30.211），且均具有統(tǒng)計學意義(P(TE13 VS.EMT)＜0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＜0.05），EMT細胞模

14、型組與TE13R120細胞組間則無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。免疫細胞化學檢測NRAGE在三組細胞中定位及胞漿胞核表達情況，三組細胞胞漿中的表達情況無明顯差別(P(TE13 VS.EMT)＞0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＞0.05、P(TE13R120 VS.EMT)＞0.05)，胞核中EMT細胞模型組和TE13R120細胞組表達明顯多于TE13細胞組(P(TE13 VS.EMT)＜0.05、P(TE13 VS.TE1