電離輻射誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及TGF-β在此過程中的作用.pdf

1、放射治療是目前腫瘤治療的重要手段之一，但治療后腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成卻嚴(yán)重影響著放療的效果。放療是否能夠直接導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移目前尚無定論，因此針對腫瘤轉(zhuǎn)移的某個關(guān)鍵環(huán)節(jié)作為靶點探討電離輻射（ionizingradiation,IR）與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系及相關(guān)機制，將為理解放療后腫瘤轉(zhuǎn)移的機制、優(yōu)化臨床放療策略提供新的思路。
　　研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移的

2、重要機制之一。在一些細胞因子、生長因子等細胞外信號的刺激下，腫瘤細胞可以通過EMT獲得遷移和侵襲能力，進而形成遠位轉(zhuǎn)移灶。其中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforminggrowthfactor-beta,TGF-β）是腫瘤細胞發(fā)生EMT的重要誘導(dǎo)因子之一。值得注意的是，相關(guān)臨床和實驗研究結(jié)果顯示，IR可以誘導(dǎo)腫瘤細胞及其周圍組織TGF-β的活化，進而引起放射性炎癥、纖維化、甚至腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此，觀察IR與EMT發(fā)生的相關(guān)性，以及

3、TGF-β在其中所發(fā)揮的作用，將為明確IR和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系提供重要的實驗證據(jù)。
　　本研究以來源于三種組織、分別具有不同轉(zhuǎn)移潛能的六種腫瘤細胞系為研究對象，通過形態(tài)學(xué)、EMT標(biāo)志物和功能學(xué)指標(biāo)研究了IR對EMT的影響，并圍繞TGF-β表達水平的變化，通過特異性通路抑制劑的應(yīng)用，進一步明確了TGF-β及其下游信號通路在IR誘導(dǎo)腫瘤細胞EMT中的作用。
　　方法：
　　1、選用人結(jié)直腸癌細胞SW480和SW620、人乳腺癌

4、細胞MCF-7和MDA-MB-231、人肺癌細胞A549和PC14六種腫瘤細胞為研究對象，對其進行2Gy60鈷（60Co）γ射線照射，通過顯微鏡觀察、免疫印跡和免疫熒光、細胞劃痕試驗以及Transwell侵襲實驗檢測其形態(tài)學(xué)、EMT標(biāo)志物、遷移和侵襲能力的變化，評價IR與EMT的相關(guān)性。
　　2、利用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）觀察2Gyγ射線照射后上述六種腫瘤細胞T

5、GF-β表達水平的改變。
　　3、采用免疫印跡法研究IR對A549細胞p-Smad2/3表達的影響，通過給與ALK-5特異性抑制劑SB431542，觀察TGF-β/Smad信號在IR誘導(dǎo)EMT中的作用。
　　4、A549細胞經(jīng)2Gyγ射線誘導(dǎo)一次后，利用克隆形成實驗檢測其放射抗性。
　　5、2Gyγ射線照射后，檢測A549細胞p-Akt的表達，通過給與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002，觀察Akt在IR誘

6、導(dǎo)EMT中的作用；聯(lián)合應(yīng)用SB431542和LY294002，探討TGF-β和Akt的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)2Gyγ射線照射后，六種腫瘤細胞均呈現(xiàn)出間質(zhì)細胞樣外觀，與對照組相比，上皮標(biāo)志物E-Cadherin和Cytokeratin表達降低，間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin和Vimentin表達增高，劃痕傷口愈合面積增大，Transwell小室穿膜細胞增多，提示本實驗條件下的IR能夠促進腫瘤細胞EMT的發(fā)生。
　

7、　2、六種腫瘤細胞經(jīng)2Gyγ射線照射后，TGF-β的表達水平明顯升高。
　　3、2Gyγ射線照射后的A549細胞p-Smad2/3的表達明顯升高；應(yīng)用TGF-β/Smad通路的抑制劑SB431542處理后，p-Smad2/3的水平降低，同時上皮標(biāo)志物E-Cadherin表達升高，間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin表達降低，劃痕傷口愈合面積及Transwell穿膜細胞也明顯減少。結(jié)果提示TGF-β/Smad信號在IR誘導(dǎo)腫瘤細胞的EMT

8、中發(fā)揮一定的作用。
　　4、經(jīng)2Gyγ射線誘導(dǎo)一次后的A549細胞再次接受γ射線照射，其存活率明顯增高，表明A549細胞的放射抗性增加。
　　5、2Gyγ射線照射后的A549細胞p-Akt的表達明顯升高；應(yīng)用PI3K/Akt通路的抑制劑LY294002處理后，p-Akt的水平降低，同時上皮標(biāo)志物E-Cadherin表達升高，間質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin表達降低，劃痕傷口愈合面積及Transwell穿膜細胞也明顯減少。結(jié)果提

9、示Akt信號在IR誘導(dǎo)腫瘤細胞的EMT中發(fā)揮一定的作用。進一步研究結(jié)果顯示，當(dāng)給與SB431542時，受照的A549細胞P-Smad2/3和p-Akt的表達均降低，而當(dāng)給與LY294002時，p-Akt表達減少，而p-Smad2/3則呈增加趨勢。提示：在IR促進腫瘤細胞發(fā)生EMT的過程中，TGF-β也可通過激活A(yù)kt通路發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：
　　IR能夠促進離體腫瘤細胞EMT的發(fā)生，TGF-β誘導(dǎo)的Smad通路和Akt通路