血糖波動對糖尿病小鼠腎臟和皮膚膠原蛋白合成的影響及機(jī)理研究.pdf

1、糖尿病的顯著特征是高血糖，糖尿病病理研究關(guān)注的重點(diǎn)是慢性持續(xù)高血糖對人體的傷害。近年來臨床醫(yī)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病的主要危害在于其慢性并發(fā)癥的發(fā)生，而糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展不僅與高血糖相關(guān)，而且與糖尿病患者血糖波動密切相關(guān)，血糖波動較大的患者發(fā)生糖尿病慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)更大。因此，要治療糖尿病，減少糖尿病慢性并發(fā)癥的危害，更需要關(guān)注血糖波動，并研究它加速機(jī)體損傷的機(jī)理，尋求控制血糖水平的方法和途徑。本實(shí)驗(yàn)的研究目的是建立靈敏、成熟、可靠的血糖

2、波動小鼠模型，來進(jìn)一步研究血糖波動后對糖尿病小鼠腎臟和皮膚膠原蛋白合成的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討，為臨床實(shí)踐提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文從以下三個(gè)方面開展研究。
　　 一、血糖波動小鼠模型的建立
　　 建立一種靈敏、成熟、可靠的血糖波動小鼠模型的方法，為在體研究血糖波動對小鼠臟器的影響提供實(shí)驗(yàn)材料和研究手段。實(shí)驗(yàn)分三組：正常對照組(N)、糖尿病模型組(D)和糖尿病波動組(DF)。DF組于每天定時(shí)腹腔注射葡萄糖溶液；同時(shí)，

3、N組和D組腹腔注射生理鹽水作為對照。小鼠飼養(yǎng)時(shí)間為8周。分別于建模前、建模后1周、4周和8周監(jiān)測各組小鼠的空腹血糖值。建模8周后，對各組小鼠平均每同的食量，水量進(jìn)行監(jiān)測。用血糖儀在一天內(nèi)進(jìn)行連續(xù)的血糖監(jiān)測，繪制“時(shí)間一血糖濃度”曲線。
　　 結(jié)果：表明，尾靜脈注射四氧嘧啶一周后，小鼠的空腹血糖值升高；在第四周和第八周時(shí)，DF組空腹血糖值繼續(xù)升高，與D組出現(xiàn)差異。八周后，D組和DF組小鼠的食量和水量相對于N組有了顯著的上升；DF組

4、小鼠的食量相比于D組有所降低；D組與DF組小鼠消耗水量無差異。一天內(nèi)的血糖值，N組小鼠為正常水平；D組小鼠血糖基礎(chǔ)值較高，波動幅度不大；DF組小鼠血糖基礎(chǔ)值最高，波動幅度較大。可見定時(shí)腹腔注射高濃度葡萄糖溶液的方法可以提高糖尿病小鼠的空腹血糖值，并能引起糖尿病小鼠出現(xiàn)大幅度的血糖波動，這種方法能夠建立靈敏、準(zhǔn)確、可靠的血糖波動小鼠模型。
　　 二、血糖波動對糖尿病小鼠腎臟膠原蛋白合成的影響及機(jī)理研究
　　 通過建立血糖波

5、動小鼠模型，檢測小鼠腎臟中I型膠原及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并對影響小鼠腎臟中I型膠原蛋白合成的細(xì)胞信號通路進(jìn)行探討。建立血糖波動小鼠模型八周后，將小鼠腎臟取出，制作小鼠腎臟組織石蠟切片，并對腎臟石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，觀察腎臟組織的形態(tài)和I型膠原的含量與分布情況；提取小鼠腎臟總mRNA和總蛋白，用RT-PCR和Westem-bloting檢測腎臟中I型膠原蛋白和相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并檢測相關(guān)通路中細(xì)胞信號因子的磷酸化程度。
　　

6、 結(jié)果：表明，D組和DF組的小鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)域細(xì)胞間空隙增多，DF組小鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)域的I型膠原染色程度較高：D組腎小球區(qū)域I型膠原染色程度要高于N組，而DF組染色程度要高于D組。mRNA表達(dá)量和蛋白含量：I型膠原，TIMP1和Tgf-β1的mRNA，DF組高于D組，D組高于N組；MMP1，DF組低于D組，D組低于N組：細(xì)胞信號因子磷酸化程度：ERK，Smad2和Smad3，DF組高于D組，D組高于N組；可見血糖波動通過活化Tgf-β信號通

7、路中Smads依賴的信號通路，增加糖尿病小鼠腎臟中膠原蛋白的合成，造成腎臟纖維化的進(jìn)一步加劇。
　　 三、血糖波動對糖尿病小鼠皮膚膠原蛋白合成的影響
　　 通過建立血糖波動小鼠模型，檢測小鼠皮膚中I型膠原及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，來研究血糖波動對小鼠皮膚膠原蛋白合成的影響。建立血糖波動小鼠模型八周后，取小鼠背部皮膚，制作石蠟切片，HE染色觀察真皮組織的形態(tài)；提取小鼠皮膚總mRNA和總蛋白，用RT-PCR和Western-bl

8、oting檢測腎臟中I型膠原蛋白和相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：表明，D組和DF組小鼠皮膚變薄，真皮層與肌肉組織間缺少脂肪組織，真皮層成纖維細(xì)胞排列較為松散，細(xì)胞間出現(xiàn)空隙。mRNA表達(dá)量：I型膠原，DF組低于D組，D組和N組無差異：MMP1，DF組高于D組，D組高于N組；Tgf-β1，DF組低于D組，D組低于N組。蛋白含量：I型膠原和TIMP1，DF組低于D組，D組低于N組；MMP1，DF組高于D組，D組高于N組。可見血糖

9、波動能夠減少糖尿病小鼠皮膚中膠原蛋白含量。綜合以上三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出如下結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的血糖波動糖尿病小鼠模型，這為今后進(jìn)一步在動物水平研究血糖波動對糖尿病小鼠的影響及機(jī)制探討提供了很好的實(shí)驗(yàn)材料和手段。
　　 2、研究發(fā)現(xiàn)血糖波動能顯著增加糖尿病小鼠腎臟組織膠原蛋白含量，血糖波動是通過活化Tgf-β信號通路中Smads依賴的信號通路促進(jìn)膠原蛋白合成增加的，因此血糖波動會造成腎臟纖維化的