藥物和生物干預(yù)抑制interleukin-1β對(duì)軟骨細(xì)胞蛋白水解酶的誘導(dǎo)作用.pdf

1、目的：骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是人類最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病。interleukin-1β(IL-1β)既是OA滑膜分泌主要炎癥因子，又是損害軟骨細(xì)胞、促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨退變的重要因素。IL-1β是引起OA癥狀和體征的主要因素之一，是OA病理生理過(guò)程的中心環(huán)節(jié)。本文探討了OA軟骨細(xì)胞體外傳代時(shí)細(xì)胞表型變化，利用青藤堿(Sinomenine，SN)和siRNA抑制IL-1β對(duì)OA軟骨細(xì)胞蛋白水解酶的誘導(dǎo)作用，尋找治療OA的藥物和方

2、法。
　　 方法：⑴OA膝關(guān)節(jié)置換切除關(guān)節(jié)軟骨，體外消化、分離、培養(yǎng)。不同代OA軟骨細(xì)胞使用real-time PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原，Aggrecan mRNA表達(dá)，免疫熒光染色檢測(cè)Ⅱ型膠原，Aggrecan含量。⑵使用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒作用，Western blot檢測(cè)MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5和GADPH蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)MMP-1、MMP-3、

3、MMP-9、MMP-13和GADPH的mRNA含量，gelatin明膠酶譜檢測(cè)培養(yǎng)上清液MMP-9的活性。⑶使用FAM熒光標(biāo)記siRNA檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，Western blot檢測(cè)IRAK-4、MMP-1、MMP-3、MMP-9和GADPH蛋白含量，或RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)。⑷采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴消化的原代(Passage0，P0)軟骨細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)＞95％

4、。絕大部分P0軟骨細(xì)胞48 h后貼壁，呈小亮點(diǎn)狀或小圓形，未完全鋪展。3日后軟骨細(xì)胞呈三角形、小圓形、短梭形和不規(guī)則形。P1、P2軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)良好，接種后約9日生長(zhǎng)融合，較P0大，胞漿內(nèi)顆粒增多，增殖良好。P3軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，3周無(wú)法生長(zhǎng)融合。
　　 ⑵P0、P1和P2軟骨細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片培養(yǎng)。P0軟骨細(xì)胞可見(jiàn)Ⅱ膠原、Aggrecan熒光信號(hào)強(qiáng)，P1、P2軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、Aggrecan熒光逐漸減弱。
　　 ⑶提

5、取P0、P1和P2軟骨細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，real-time PCR檢測(cè)不同代軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan表達(dá)。P0、P1和P2軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、Aggrecan mRNA表達(dá)隨傳代增加而迅速減少。
　　 ⑷MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，小于等于5 mmol/L的濃度范圍內(nèi)SN作用24 h，SW1353和OA軟骨細(xì)胞活力正常，低濃度能刺激細(xì)胞增殖；大于5 mmol/L的濃度可見(jiàn)細(xì)胞活力下降明顯，細(xì)胞數(shù)量減少。
　　 ⑸SW

6、1353和OA軟骨細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后加入SN，30 min后IL-1β刺激24 h。SN可以抑制IL-1β誘導(dǎo)MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13mRNA表達(dá)，抑制作用呈劑量依賴性。上清中IL-1β誘導(dǎo)的MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白在SN的作用下也呈劑量依賴性抑制。MMP-3在細(xì)胞中含量高，IL-1β刺激后表達(dá)升高，5 mmol/L SN可明顯抑制其表達(dá)。
　　 ⑹Gelatin

7、明膠酶譜結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞分泌MMP-9活性增加，SN作用下抑制IL-1β對(duì)SW1353和OA軟骨細(xì)胞的該作用。
　　 ⑺ADAMTS是另一群軟骨分解代謝因子，可以導(dǎo)致軟骨基質(zhì)中蛋白多糖等成分破壞、降解。ADAMTS-4分泌量少，ADAMTS-5表達(dá)明顯，IL-1β誘導(dǎo)后表達(dá)增加，結(jié)果顯示青藤堿以劑量依賴的方式抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5分泌。
　　 ⑻以IRAK-4(NM_016123)為模板，選取

8、4對(duì)siRNA，長(zhǎng)度為19bp，Blast結(jié)果排除siRNA88-106、siRNA631-649、siRNA733-751和siRNA904-922和其他編碼序列/EST同源性。化學(xué)合成法合成3'端以dTdT結(jié)尾的siRNA。
　　 ⑼Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染OA軟骨細(xì)胞后2 h顯微鏡下觀察可見(jiàn)吞噬泡，細(xì)胞形態(tài)較轉(zhuǎn)染前無(wú)明顯改變，轉(zhuǎn)染后6 h終止轉(zhuǎn)染時(shí)，胞內(nèi)吞噬泡較2 h增多。6 h后終止轉(zhuǎn)染的0A軟骨細(xì)生長(zhǎng)良好

9、。FAM標(biāo)記si RNA轉(zhuǎn)染后6 h見(jiàn)胞內(nèi)綠色熒光分布。
　　 ⑽IL-1β誘導(dǎo)后OA軟骨細(xì)胞IRAK-4 mRNA和蛋白含量較空白對(duì)照減少。4對(duì)siRNA干擾72 h，各組IRAK-4 mRNA和蛋白含量較空白對(duì)照、IL-1β組少，siRNA904-922組IRAK-4含量減少最明顯。
　　 ⑾siRNA干擾48 h后給予IL-1β刺激24 h，siRNA88-106明顯抑制I L-1β誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞MMP-9、MM

10、P-13 mRNA表達(dá)；siRNA631-649明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)；siRNA733-751和siRNA904-922明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)。
　　 ⑿FAM標(biāo)記siRNA轉(zhuǎn)染OA軟骨細(xì)胞，6 h后更換培養(yǎng)液。熒光顯微鏡觀察見(jiàn)胞漿內(nèi)綠色熒光，熒光強(qiáng)度隨siRNA濃度增加而增強(qiáng)。
　　

11、 ⒀干擾不同時(shí)間(0，24，48，72，96，120，144，168 h)的結(jié)果顯示，24 h后IRAK-4蛋白含量較0 h明顯減少，48、72 h后IRAK-4表達(dá)微弱，此后IRAK-4蛋白含量逐漸增加，但168 h后仍未達(dá)空白對(duì)照水平。MMP-1，MMP-9蛋白無(wú)IL-1β刺激時(shí)表達(dá)弱，在48，72，96，120，144，168 h隨著時(shí)間延長(zhǎng)MMP-1，MMP-9蛋白表達(dá)逐漸增加。
　　 ⒁siRNA904-922(25，

12、50，75，100 nmol/L)和不同處理作用0A軟骨細(xì)胞72 h。25 nmol/L siRNA904-922干擾下，IRAK-4蛋白減少不明顯，50、75、100 nmol/L時(shí)干擾效果強(qiáng)于25 hmol/L，陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、Lipofectamine2000處理對(duì)IRAK-4蛋白無(wú)明顯影響。MMP-3在25 nmol/LsiRNA904-922作用下稍減少。50、75、100 nmol/L siRNA904-922作用72

13、h后MMP-3條帶減弱，三個(gè)濃度間差別不明顯。
　　 結(jié)論：①P0、P1、P2 OA軟骨細(xì)胞增殖能力較好，P3細(xì)胞增殖緩慢。P0、P1、P2三代OA軟骨細(xì)胞，Ⅱ型膠原、Aggrecan mRNA和大分子水平隨傳代增加而減少。②利用OA軟骨細(xì)胞進(jìn)行研究時(shí)，盡量用代數(shù)前的細(xì)胞，原代細(xì)胞數(shù)量少，使用擴(kuò)增后的原代細(xì)胞較為可行。③SN在小于等于5 mmol/L濃度范圍，24 h內(nèi)未影響SW1353和OA軟骨細(xì)胞活力，是應(yīng)用于OA軟骨細(xì)胞的

14、安全濃度范圍。④SN可抑制I L-1β誘導(dǎo)SW1353和OA軟骨細(xì)胞多種蛋白水解酶mRNA表達(dá)或蛋白分泌，抑制作用呈劑量依賴性。⑤SN具有抑制I L-1β誘導(dǎo)MMP和ADAMTS表達(dá)，保護(hù)OA軟骨細(xì)胞的作用。SN有可能成為新的OA治療藥物。⑥siRNA904-922對(duì)OA軟骨細(xì)胞IRAK-4沉默效好，明顯抑制I L-1β誘導(dǎo)OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞多種MMP mRNA表達(dá)。⑦50 nmol/L作為siRNA904-922使用濃度，siRNA90