草酰乙酸脫羧酶及蛋白水解酶晶體結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、草酰乙酸脫羧酶(EC4.1.1.3)催化草酰乙酸脫羧形成丙酮酸和二氧化碳。這個(gè)蛋白家族大體上分為兩類，一類是膜蛋白復(fù)合體Na+泵亞家族，另外一類是存在于胞質(zhì)的可溶性草酰乙酸脫羧酶亞家族。
　　 Cg1458是來源于谷氨酸棒桿菌中的可溶性草酰乙酸脫羧酶，序列比對(duì)結(jié)果顯示它屬于富馬酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH)家族蛋白。FAH是催化酪氨酸和苯丙氨酸代謝途徑最后一步反應(yīng)的代謝酶類

2、，它水解富馬酰乙酰乙酸產(chǎn)生的乙酰乙酸和富馬酸會(huì)繼續(xù)參與到檸檬酸循環(huán)中。FAH家族已有很多成員的結(jié)構(gòu)被解析，但是沒有一個(gè)成員被報(bào)道具有草酰乙酸脫羧酶活性。對(duì)Cg1458結(jié)構(gòu)的研究有助于了解其脫羧的作用機(jī)理。
　　 膜蛋白復(fù)合體草酰乙酸脫羧酶屬于Na+離子轉(zhuǎn)運(yùn)脫羧酶家族，它們將草酰乙酸脫羧產(chǎn)生的能量將Na+離子泵出胞外，由此產(chǎn)生的Na+離子梯度可用于進(jìn)行溶質(zhì)的吸收，鞭毛的運(yùn)動(dòng)或是通過F型ATP合酶來合成ATP。雖然來源于霍亂弧菌草酰

3、乙酸脫羧酶的α亞基的羧基轉(zhuǎn)移活性結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，但這個(gè)結(jié)構(gòu)的解析尚不能夠?qū)︳然霓D(zhuǎn)移及脫羧的具體機(jī)理作出明確的回答，同時(shí)也由于沒有相應(yīng)的β亞基的三維結(jié)構(gòu)，因此具體的脫羧機(jī)制及鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制都不清楚。對(duì)復(fù)合體蛋白的表達(dá)純化條件的摸索，有助于獲得穩(wěn)定并且狀態(tài)均一的復(fù)合體蛋白，為后續(xù)獲得高質(zhì)量的草酰乙酸復(fù)合體晶體奠定基礎(chǔ)。
　　 為了研究可溶性的草酰乙酸脫羧酶的特性及其催化機(jī)制，我們克隆表達(dá)并純化得到了Cg1458草酰乙

4、酸脫羧酶。通過對(duì)其生化特性的鑒定，我們發(fā)現(xiàn)Cg1458的最適反應(yīng)pH值為Tris-HCl pH8.0，其活性可被一些二價(jià)金屬離子如Mg2+，Mn2+，Ca2+，Co2+，Ni2+，Cu2+等激活，當(dāng)用EDTA螯合掉蛋白中的金屬離子時(shí)，Cg1458則完全喪失了活性，當(dāng)加入某些二價(jià)金屬離子如Mg2+，Mn2+，Ca2+及Co2+則可回補(bǔ)Cg1458的活力。我們發(fā)現(xiàn)草酸是Cg1458的一種抑制劑，5mM草酸即可完全抑制Cg1458的活力。運(yùn)用

5、氣相擴(kuò)散方法我們還獲得了Cg1458野生型蛋白的晶體及其與草酸共結(jié)晶的復(fù)合體的晶體，并分別收集到1.9(A)和2.0(A)的衍射數(shù)據(jù)，運(yùn)用FAH家族蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID2DFU)作為模板，通過分子置換的方法分別解析了Cg1458的野生型及復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。在草酸復(fù)合體晶體中存在一段在野生型晶體中缺失的loop區(qū)，這段loop區(qū)可以作為蓋子，在底物進(jìn)入活性中心時(shí)阻斷底物通道，在完成反應(yīng)循環(huán)后打開使產(chǎn)物釋放。通過對(duì)Cg1458結(jié)構(gòu)進(jìn)

6、行分析，我們找到了一些可能的催化位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行了定點(diǎn)突變，分別純化了突變體蛋白并測(cè)定其草酰乙酸脫羧酶活力，結(jié)果顯示除Cg1458 E76A突變體還剩余35％酶活力外，其余突變體均喪失酶活力。根據(jù)Cg1458及突變體的生化特性及兩種構(gòu)象的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合分子模擬實(shí)驗(yàn)，我們提出Cg1458中的蓋子結(jié)構(gòu)域是一種具有催化活性的蓋子結(jié)構(gòu)域，Cg1458的催化機(jī)制為一種Glu-His-water三聯(lián)體的催化機(jī)制。通過對(duì)FAH家族蛋白已經(jīng)解析的晶體結(jié)構(gòu)

7、的比較及大規(guī)模的同源序列比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)這種三聯(lián)體的催化機(jī)制是一種在FAH家族蛋白中催化C-C鍵水解的通用機(jī)制。
　　 為了解析草酰乙酸脫羧酶復(fù)合體的三維晶體結(jié)構(gòu)，首先必須獲得大量狀態(tài)均一的草酰乙酸脫羧酶復(fù)合體，前期的研究均顯示草酰乙酸脫羧酶復(fù)合體不是很穩(wěn)定。因此我們嘗試著表達(dá)來源于海洋細(xì)菌Staphylothermus marinus F1菌株的草酰乙酸脫羧酶復(fù)合體，并對(duì)來源于霍亂弧菌的草酰乙酸脫羧酶進(jìn)行了一系列的改造，包括將β

8、亞基單獨(dú)表達(dá)或與其它亞基進(jìn)行融合表達(dá)，以及在β亞基的不同位置引入his-tag等，以期獲得狀態(tài)均一的草酰乙酸脫羧酶復(fù)合體。結(jié)果表明，來源于海洋細(xì)菌S.marinus F1的草酰乙酸脫羧酶復(fù)合體在受試條件下沒有獲得異源表達(dá)產(chǎn)物。對(duì)來源于霍亂弧菌的草酰乙酸脫羧酶復(fù)合體的改造試驗(yàn)，我們不能獲得單獨(dú)以及亞基融合表達(dá)的表達(dá)產(chǎn)物。在β亞基上添加his-tag的表達(dá)試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在110位引入his-tag導(dǎo)致復(fù)合體完全不能表達(dá);而在256位及30

9、0位引入his-tag，草酰乙酸脫羧酶復(fù)合體都能表達(dá)，但只有256位引入his-tag的復(fù)合體蛋白具有草酰乙酸脫羧酶活性。因此我們還篩選了純化該蛋白時(shí)選用的去污劑，并分別用不同的去污劑對(duì)其進(jìn)行了純化。發(fā)現(xiàn)在以麥芽糖苷類非極性去污劑純化復(fù)合體的時(shí)候，能夠較好地提純到β亞基，這些工作為獲得大量狀態(tài)均一的復(fù)合體蛋白奠定了基礎(chǔ)。
　　 蛋白水解酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，是酶學(xué)中較早也較深入研究的一類酶。TTHA1296蛋白水解酶是極端

10、嗜熱菌Thermus thermophilus HB8中基因編碼的一種以Ser/Lys二聯(lián)體為活性中心的絲氨酸蛋白水解酶。為了明確TTHA1296的特性及催化機(jī)理，在前期我們找到了能被TTHA1296特異性切割的底物蛋白Oad525的基礎(chǔ)上。我們運(yùn)用這個(gè)底物對(duì)TTHA1296的生化特性進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其突變體蛋白TTHA1296 S295A進(jìn)行了結(jié)晶條件的篩選。為了確定TTHA1296切割底物的位置，我們選擇了Oad525及同樣表達(dá)方式

11、表達(dá)的更短的Oad454作為底物，結(jié)果顯示TTHA1296能切割Oad525而不能切割Oad454，因此我們判定，TTHA1296切割底物的C末端。通過對(duì)其生化特性進(jìn)行研究，我們發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH為6.0，并且有很好的熱穩(wěn)定性，在85℃處理下仍有大部分酶蛋白以可溶性蛋白形式存在，且還保留有蛋白水解酶活性。TTHA1296的酶活性不受常規(guī)蛋白酶抑制劑和金屬離子的影響。對(duì)TTHA1296的突變體蛋白TTHA1296 S