外源性EGF促細(xì)胞增殖作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和安全性研究及EGF藥源開發(fā).pdf

1、表皮生長因子(epidermal growth factor,縮寫EGF)，是一強(qiáng)有力的細(xì)胞分裂因子，主要由頜下腺管細(xì)胞分泌。 EGF對上皮細(xì)胞有促增殖作用，外源性EGF在臨床中的應(yīng)用開始于創(chuàng)傷治療方面：如體表創(chuàng)傷、潰瘍，角膜損傷等。由于人體大多數(shù)的EGF存在于消化道，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于循環(huán)中的EGF濃度，因此，EGF對消化道黏膜有效的保護(hù)作用使外源性EGF用于消化道疾病治療成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)EGF和EGF受體(EGFR)

2、拮抗劑可以影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和消退，因此在臨床中EGF的應(yīng)用由于它潛在的安全性問題而受到了制約。由于EGF與EGFR激活及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路十分復(fù)雜，病理生理功能多樣，而Bel-2、p53基因蛋白表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，故迫切需要進(jìn)一步研究它們在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐中的地位。文的內(nèi)容分以下兩個(gè)部分： 第一部分：外源性EGF促FL細(xì)胞增殖作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其安全性評價(jià)研究 目的：探討EGF促FL細(xì)胞增殖時(shí)激活Ras/R

3、af/IVIEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)間一劑量-效應(yīng)關(guān)系及對Bcl-2、p53蛋白表達(dá)的影響。 材料與方法： 1.MTT法檢測細(xì)胞增殖：細(xì)胞以2×108/L的密度接種于96孔板上，每孔100μl。待細(xì)胞貼璧生長后換含不同濃度rhEGF(0.1、1、10、30、60 μg)的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，對照孔以生理鹽水代替rhEGF。觀察細(xì)胞生長形態(tài)學(xué)變化并分別在第1、2、3、4、5 d取樣；或換含rhEGF(10μl/L)+不

4、同濃度PD98059(25、50、75 μmol/L)的MEM培養(yǎng)基100μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取樣后每孔加入MTT20μl，孵育4 h后棄上清，每孔加150 μlDMS0，振蕩10 min，于酶標(biāo)儀490nm波長下測定各孔的吸光度A值。細(xì)胞增殖率：(實(shí)驗(yàn)組A值一對照組A值)/對照組A值×100％。 2.Western蛋白印跡法檢測Ras/Raf/MEK/ERK通路及Bcl-2、p53蛋白水平：待細(xì)胞貼璧生長后換用rhEGF終

5、濃度為1、10、60 μl/L無血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；測定MAPK通路抑制劑PD98059的影響則分別加入終濃度為25，50，75μmol/L的PD98059，預(yù)處理1 h。實(shí)驗(yàn)開始后根據(jù)需要在不同時(shí)段用胰酶消化，收集細(xì)胞并加細(xì)胞裂解液，取上清液，Bradford法測蛋白濃度。每孔加50μg的蛋白樣品電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)PVDF膜，將轉(zhuǎn)有蛋白的膜置于5％BSA封閉，經(jīng)一抗和HRP標(biāo)記的二抗處理后，在暗室，取ECL發(fā)光試劑A、B液各1

6、ml，混合后覆蓋于膜上1.5 min，最后用X光膠片進(jìn)行曝光、顯影及定影。 結(jié)果： 1.FL細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)48小時(shí)后，生理鹽水對照組基本以多邊形居多，而加入rhEGF后細(xì)胞以長條紡錘形居多。 2.第l～5天中，1～60 μg幾濃度組促細(xì)胞增殖率明顯增高(P<0.01)。rhEGF濃度10 μg幾第3天時(shí)達(dá)到最高(42.4％，P

7、0.01)。 3.各濃度PD98059可明顯抑制EGF促FL細(xì)胞增殖作用(P<0.01)，且隨著劑量的加大其抑制作用愈明顯。 4.不同濃度rhEGF刺激30 min后p-Raf、p-ERK1/2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)灰度分析結(jié)果示rhEGF 1～60 μg/L濃度組p-Raf、p-ERK1/2蛋白較對照組明顯升高(P<0.05)，尤以10μg/L濃度組的作用最強(qiáng)。而非磷酸化ERK 1/2的表達(dá)無明顯變化。 5.rhEGF

8、濃度10μg/L刺激FL細(xì)胞后測定連續(xù)時(shí)間段(0 min，5 min，30 min，1h，2 h)p-Raf、p-ERK1/2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果示刺激第5 min～2 h各時(shí)間段p-Raf、p-ERK1/2活性表達(dá)呈峰型曲線，其中第5 min時(shí)p-Raf、p-ERK1/2活性最高(P<0.01)，隨后各時(shí)間段p-Raf、p-ERK1/2活性開始下降。2 h后p-Raf表達(dá)的水平即明顯下降到刺激前的水平，與對照組無明顯差別(P>0.05)；

9、而2h后p-ERK1/2表達(dá)的水平甚至低于刺激前的水平(P<0.05)。 6.與對照組比較，灰度分析結(jié)果示各濃度組PD98059(25，50，75 u mol/L)可明顯抑制rhEGF促p-ERK1/2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)(P<0.01)。且PD98059抑制p-ERK1/2蛋白的表達(dá)有劑量依賴性，隨著PD98059劑量的加大，抑制p-ERK1/2蛋白表達(dá)的作用增強(qiáng)。 7.與對照組比較，受不同濃度rhEGF刺激1 h后Bcl-2

10、蛋白表達(dá)灰度分析結(jié)果示1～60 μg/L濃度組Bc卜2蛋白表達(dá)較對照組明顯增高(P<0.05)；rhEGF 1～60 μg幾濃度組p53蛋白明顯下降(P<0.01)。其中rhEGF1 μg/L濃度組的作用最弱，10 μg/L濃度組的最強(qiáng)，兩組之間比較有顯著差異(P<0.01)。 8.以rhEGF 10 μg/L的刺激濃度觀測0 min，30 min，1 h，2 h，4 h五個(gè)時(shí)間段的Bcl-2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果示30 min~4

11、h時(shí)間段的表達(dá)呈峰型曲線，以1h時(shí)間段的表達(dá)最高(P<0.01)，隨后開始下降。與rhEGF 10μg幾的濃度刺激后p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平比較，各時(shí)間段Bcl-2與p-ERK1/2的峰型變化曲線基本一致。 結(jié)論： EGF促FL細(xì)胞增殖、激活Ras/Raf/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及對Bcl-2、p53蛋白的表達(dá)有明顯的劑量和時(shí)間依賴性作用。EGF濃度10μg幾是最強(qiáng)的刺激濃度，F(xiàn)L細(xì)胞對此濃度EGF的刺激具有自

12、適應(yīng)控制作用。1μg幾濃度的EGF可能是既發(fā)揮生理效應(yīng)又較為安全的用量。 第二部分：羊頜下腺表皮生長因子提取、純化及生物活性鑒定的研究 目的：從山羊頜下腺分離、純化具有生物學(xué)活性的EGF。 方法： 1.羊EGF的提取、純化：首先進(jìn)行EGF的粗分離，稱取山羊頜下腺(新鮮或冷凍)，解凍后剪去結(jié)締組織，用剪刀剪成小塊，用攪拌機(jī)攪碎，然后放入勻漿器勻漿，按比例加入冰醋酸(HAC)，操作在4℃冰浴中進(jìn)行50 000

13、×g，離心30 min，抽取上清液。進(jìn)行DEAE Sphacel陰離子交換柱分離，收集洗脫液，UV-280hm檢測圖分析吸光度，選出的管數(shù)做ELISA實(shí)驗(yàn)。并以0.2 M醋酸銨和EGF標(biāo)準(zhǔn)品做為陰性、陽性對照，以檢測EGF活性成分。不加硫酸(在652nm處的讀數(shù))及加酸后(在450nm處讀數(shù))的結(jié)果分析。讀數(shù)高、和EGF標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)接近為有EGF活性組份的可能，將這些組份合并后進(jìn)行透析脫去鹽分(透析袋分子量為3 500)，透析過夜。將透析

14、好的組份分別用甘油(丙三醇)或聚乙二醇(分子量20 000)進(jìn)行濃縮以除去水分。透析濃縮后的組份再次進(jìn)行EIASA實(shí)驗(yàn)。將含有EGF成分的濃縮液過分子篩色譜(Sephadex G50)柱層析，根據(jù)層析圖所示，選取對應(yīng)的收集管再次進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，步驟同前，結(jié)果吸光度值高的幾管與層析圖中的一個(gè)峰所對應(yīng)，因此該峰就是含有EGF的活性峰。 2.對提取、純化的羊EGF進(jìn)行生物活性檢測 2.1 MTT法測定不同濃度羊EGF對人胚

15、胎羊膜細(xì)胞FL的促增殖作用。 2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測羊EGF促細(xì)胞增殖時(shí)細(xì)胞周期變化。 3.純化的山羊頜下腺EGF行SDS—PAGE電泳觀測其可見的分子量條帶位置。 結(jié)果： 1.48小時(shí)后貼璧生長的FL細(xì)胞逐漸以多邊形居多，而加入EGF后細(xì)胞以長條紡錘形居多。 2.MTT法促增殖實(shí)驗(yàn)：結(jié)果顯示不同濃度羊頜下腺EGF組(稀釋倍數(shù)：1：100、1：500、1：1000)、rhEGF(10μg幾)組對FL

16、細(xì)胞的促增殖率分別為20.90％、39.43％、24.90％和40.60％。與對照組比較，羊頜下腺分離的EGF可明顯促進(jìn)FL細(xì)胞的生長(P<0.01)，以稀釋1：500倍的羊EGF作用效果最強(qiáng)，其促FL細(xì)胞增殖率與人重組EGF比較無明顯差異(P>0.05)。 3.流式細(xì)胞術(shù)：根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中確立的最佳羊EGF稀釋濃度觀測流式細(xì)胞術(shù)中羊EGF對細(xì)胞周期的影響，與對照組相比較，結(jié)果顯示作用48 h后，G0/G。期細(xì)胞百分比由71.1

17、±1.9減少至60.3±2.2(P<0.01)，S期細(xì)胞百分比由18.8±1.4增高至25.8±1.1(P<0.01)，純化的山羊頜下腺EGF顯著刺激細(xì)胞由G0/G。期進(jìn)入S期，使分布在S期的細(xì)胞數(shù)增加。 3.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：電泳結(jié)果顯示在分子量6 kD處，可見明顯的條帶。 結(jié)論： 從山羊頜下腺分離得到的蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定為EGF，該EGF能明顯促進(jìn)FL細(xì)胞生長、顯著提高細(xì)胞的S期細(xì)胞分?jǐn)?shù)，為具有生物學(xué)活性