SelS保護ECV-,304-細胞免于過氧化氫損傷與窖蛋白-1的關系研究.pdf

1、目的： 從人脂肪組織中克隆SelS基因片段，構建pcDNA3.1-SelS真核表達載體。將pcDNA3.1-SelS瞬時轉染至人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(ECV304)中，分別從mRNA水平及蛋白水平檢測SelS基因在ECV304細胞中的表達。瞬時轉染后將ECV304細胞分為未轉染組、SelS轉染組(SelS高表達組)及空載體轉染組，以不同濃度的過氧化氫( H2O2)損傷后，觀察各組細胞損傷前后的氧化應激指標及窖蛋白-1 (Caveol

2、in-1．Cav-1)表達水平的差異，探討Caveolin-1是否與SelS抗氧化作用有關。為深入研究SelS內(nèi)皮保護的作用機制提供新的實驗依據(jù)。 方法： 1．采用RT-PCR方法從人脂肪組織中獲取SelS基因片段(79～645bp)，通過兩次亞克隆將目的基因克隆于pcDNA3.1真核表達載體中，獲得真核表達載體質(zhì)粒pcDNA3.1-SelS，并行EcoRI/XhoI酶切鑒定及測序鑒定。 2．應用脂質(zhì)體轉染技術分

3、別將pcDNA3.1-SelS及pcDNA3.1瞬時轉染至ECV304細胞中，從而將ECV304細胞分為SelS轉染組及空載體轉染組，同時以未轉染組ECV304細胞作為對照。以GAPDH為內(nèi)參照半定量檢測SelS mRNA水平的表達；以β-actin為內(nèi)參照，Western blot方法檢測SelS蛋白水平的表達。 3．各組細胞分別經(jīng)含有終濃度為0、400、600、800、1000μmol/L，的H2O2的培養(yǎng)液作用6小時后，四

4、甲基偶氮唑藍法(MTT)觀察H2O2對細胞增殖能力的影響：取不同濃度各組細胞上清液，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)的含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活力。 4．根據(jù)MTT結果，選取細胞生存率適度減低的含H2O2濃度800μmol/L，的培養(yǎng)液作用各組細胞6小時后，提取各組細胞總RNA，采用RT-PCR方法檢測各組細胞Caveolin-1的mRNA表達水平。 結果： 1．從人脂肪組織中提取的總

5、RNA是完整的，SelS基因cDNA測序結果與Genebank中的序列(NM-018445)相一致。經(jīng)XhoI和EcoRI酶切及測序鑒定證實pcDNA3.1-SelS真核表達載體質(zhì)粒構建成功。 2．RT-PCR、Western blot檢測證實SelS在ECV304細胞中有內(nèi)源性表達，同時半定量分析顯示SelS轉染組的SelSmRNA及蛋白表達水平均較未轉染組及空載體轉染組明顯升高(P<0.01)，未轉染組與空載體轉染組表達無差

6、異(P<0.01)。 3．細胞生存率(％)：ECV304細胞暴露于含不同濃度的H2O2的培養(yǎng)液中6小時后，細胞生存率明顯下降：在H2O2濃度為800、1000μmol/L時，SelS轉染組(34±10，27±15)的細胞生存率明顯高于未轉染組(32±12，24±9)及空載體轉染組(31±14，23±10) (P<0.01)，空載體轉染組與未轉染組相比差異不顯著(P>0.05)。 4．MDA含量(nmol/mL)：各組細胞

7、上清液中MDA的含量隨著H2O2濃度的升高而增加；在H2O2濃度為600、800、1000μmol/L時，SelS轉染組的MDA水平(3.50±0.07，6.30±0.07，10.50＋0.08)均低于未轉染組(6.40±0.03，10.40±0.11，18.00±0.07)及空載體轉染組(5.80±0.08，9.00±0.09，16.40±0.19)，H2O2濃度為1000μmol/L時差異更為顯著(P<0.05，P<0.05，P<0

8、.01)，空載體轉染組與未轉染組相比差異不顯著(P>0.05)。 5．SOD活力(U/ml)：各組細胞上清液中SOD的活力隨著H2O2濃度的升高而減弱；在H2O2濃度為600、800、1000μmol/L時，SelS轉染組的SOD活力(8.34±0.16，7.48±0.87，6.60±1.58)明顯高于未轉染組(7.52±0.29，5.70±0.22，4.62±2.33)及空載體轉染組(7.12±1.63，6.10±1.78，5

9、.00±1.27)，在H2O2濃度800、1000μmol/L時升高更為明顯(P<0.05，P<0.01，P<0.01)；空載體轉染組與未轉染組相比無差異(P>0.05)。 6．Caveolin-1 mRNA的表達：ECV304細胞暴露于含不同濃度H2O2的培養(yǎng)液中6小時后，與損傷前相比，未轉染組(0.74±0.01 vs 0.48+0.01，P<0.01)、SelS轉染組(0.67±0.01 vs 0.63±0.01，P<0.

10、05)及空載體轉染組(7.12±1.63 vs 0.58±0.01，P<0.01)均明顯升高：H2O2損傷后，SelS轉染組(0.67+0.01)明顯低于未轉染組(0.74±0.01)(P<0.01)及空載體轉染組(7.12±1.63)(P<0.01)，而未轉染組與空載體轉染組比較無差異(P>0.05)。 結論： 1．成功構建pcDNA3.1-SelS真核表達載體，將pcDNA3.1-SelS瞬時轉染至ECV304細胞中