硒蛋白S基因表達(dá)與過氧化氫介導(dǎo)的ECV-,304-細(xì)胞損傷關(guān)系的研究.pdf

1、目的：體外構(gòu)建含shRNA的硒蛋白S（Selenoprotein S，SelS）基因干擾質(zhì)粒及SelS基因高表達(dá)質(zhì)粒，將其瞬時轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（ECV304）中，將ECV304細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組、SelS高表達(dá)組、空載體轉(zhuǎn)染組及SelS低表達(dá)組，以不同濃度的過氧化氫（H2O2）損傷后，觀察各組細(xì)胞損傷前后的氧化應(yīng)激指標(biāo)及窖蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）、蛋白激酶Cα（PKCα）表達(dá)水平的差異，探討SelS的作用是否通

2、過PKC通路發(fā)揮作用，及此通路與Cav-1的關(guān)系，為研究內(nèi)皮保護(hù)策略提供新的實驗依據(jù)。 方法： 1．構(gòu)建三條含shRNA的SelS基因干擾質(zhì)粒及SelS基因高表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至ECV304細(xì)胞中，以GAPDH為內(nèi)參照半定量檢測SelS mRNA水平的表達(dá)，篩選有效干擾質(zhì)粒。 2．將ECV304細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組、SelS高表達(dá)組、空載體轉(zhuǎn)染組及SelS低表達(dá)組，以GAPDH為內(nèi)參照，實時定

3、量PCR方法檢測SelS mRNA水平的表達(dá)；以β-actin為內(nèi)參照，Western blot方法檢測SelS蛋白水平的表達(dá)。 3．各組細(xì)胞分別經(jīng)含有終濃度為0、400、600、800及1000μmol/L的H2O2的培養(yǎng)液作用6h后，四甲基偶氮唑藍(lán)法（MTT）觀察H2O2對細(xì)胞增殖能力的影響；取不同濃度損傷的各組細(xì)胞上清液，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）的含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）的活力。

4、4．根據(jù)MTT結(jié)果，以H2O2濃度為800μmol/L的培養(yǎng)液作用各組細(xì)胞24h后，提取各組細(xì)胞總RNA及總蛋白，采用實時定量PCR方法檢測各組細(xì)胞Cav-1及PKCα mRNA水平的表達(dá)；Western blot方法檢測Cav-1及PKCα蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建SelS基因干擾質(zhì)粒及SelS基因高表達(dá)質(zhì)粒，而且設(shè)計的三條干擾質(zhì)粒均可干擾內(nèi)皮細(xì)胞中SelS基因的表達(dá)。實時定量PCR及Western blo

5、t證實SelS低表達(dá)組的SelS mRNA及蛋白表達(dá)水平均較未轉(zhuǎn)染組、SelS高表達(dá)組及空載體轉(zhuǎn)染組明顯減低，未轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組表達(dá)無差異（P>0．05）。 2．細(xì)胞生存率（%）；ECV304細(xì)胞暴露于含不同濃度的H2O2的培養(yǎng)液中6h后，細(xì)胞生存率明顯下降；各濃度組的細(xì)胞生存率在SelS低表達(dá)組（84±2．0、69±1．0、60±1．5、42±1．5、23±2．0）均較未轉(zhuǎn)染組、SelS高表達(dá)組及空載體轉(zhuǎn)染組低（P<0．0

6、1）；在H2O2濃度為800、1000μmol/L時，SelS高表達(dá)組（71±1．5，63±2．6）的細(xì)胞生存率明顯高于未轉(zhuǎn)染組（64±0．5，45±2．6，P<0．01）及空載體轉(zhuǎn)染組（63±1．5，42±3．5，P<0．01）；空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比差異不顯著（P>0．05）。 3．MDA含量（nmol/ml）：各組細(xì)胞上清液中MDA的含量隨著H2O2濃度的升高而增加；在H2O2濃度為600μmol/L時，SelS低表達(dá)

7、組（6．52±0．16）的MDA水平高于SelS高表達(dá)組（3．69±0．16，P<0．05）；在H2O2濃度為800、1000μmol/L時，SelS低表達(dá)組（15．43±0．99，27．00±0．70）的MDA水平則高于未轉(zhuǎn)染組（10．10±0．40，17．97±0．48，P<0．05）及空載體轉(zhuǎn)染組（9．50±0．46，16．60±0．80，P<0．05）；SelS高表達(dá)組的MDA水平在這三個濃度（3．69±0．16，6．24±0．

8、51，10．41±0．35）均低于未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組（P<0．05）；H2O2濃度為1000μmol/L時差異更為顯著（P<0．01）；空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比差異不顯著（P>0．05）。 4．SOD活力（U/ml）：各組細(xì)胞上清液中SOD的活力隨著H2O2濃度的升高而減弱；在H2O2濃度為600、800、1000μmol/L時，SelS低表達(dá)組（6．62±0．53，5．09±1．65，3．48±0．88）的SOD活力則明

9、顯低于未轉(zhuǎn)染組（7．52±0．29，5．70±0．22，4．62±2．33）及空載體轉(zhuǎn)染組（7．12±1．63，6．10±1．78，5．00±1．27）（P<0．05，P<0．01，P<0．01），在H2O2濃度800、1000μmol/L時減低更為明顯（P<0．01，P<0．01）； SelS高表達(dá)組的SOD活力（8．34±0．16、7．48±0．87、6．60±1．58）明顯高于未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組，在H2O2濃度800、1000

10、μmol/L時升高更為明顯（P<0．01，P<0．01）；空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比無差異（P>0．05）。 5．Cav-1的表達(dá)：ECV304細(xì)胞暴露于含800μmol/L H2O2的培養(yǎng)液中24h后，Cav-1 mRNA表達(dá)在未轉(zhuǎn)染組（1．56±0．07 vs1．14±0．04，P<0．01）、SelS高表達(dá)組（1．27±0．05 vs0．85±0．25，P<0．01）、空載體轉(zhuǎn)染組（1．52±0．08 vs0．93±0．0

11、5，P<0．01）及SelS低表達(dá)組（2．84±0．07 vs0．87±0．06，P<0．01）均較損傷前明顯升高；H2O2損傷后，SelS低表達(dá)組（2．84±0．07）明顯高于未轉(zhuǎn)染組（P<0．01）、SelS高表達(dá)組（P<0．01）及空載體轉(zhuǎn)染組（P<0．01），SelS高表達(dá)組（1．27±0．05）明顯低于未轉(zhuǎn)染組（1．56±0．07，P<0．01）及空載體轉(zhuǎn)染組（1．52±0．08，P<0．01），而未轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組比較無

12、差異（P>0．05）。H2O2損傷后與損傷前相比，Cav-1蛋白水平表達(dá)在未轉(zhuǎn)染組（1．74±0．02 vs1．25±0．01，P<0．01）、SelS高表達(dá)組（1．45±0．04 vs1．23±0．02，P<0．01）、空載體轉(zhuǎn)染組（1．79±0．04vs1．24±0．02，P<0．01）及SelS低表達(dá)組（2．37±0．02 vs1．26±0．15，P<0．01）均明顯升高；H2O2損傷后，SelS低表達(dá)組Caveolin-1蛋白表

13、達(dá)（2．37±0．02）明顯高于未轉(zhuǎn)染組（P<0．01）、SeIS高表達(dá)組（P<0．01）及空載體轉(zhuǎn)染組（P<0．01），而SelS高表達(dá)組（1．45±0．04）明顯低于未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組（P<0．01）；而未轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組比較無差異（P>0．05）。 6． PKCα的表達(dá)：H2O2損傷后，SelS低表達(dá)組PKCα mRNA表達(dá)水平較損傷前升高（8．70±0．43 vs3．11±0．13，P<0．01）；而未轉(zhuǎn)染組（2

14、．70±0．39vs2．59±0．22）、空載體轉(zhuǎn)染組（2．98±0．64 vs2．79±0．26）及SelS高表達(dá)組（2．74±0．55 vs2．62±0．25）在損傷前后則無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0．05）；H2O2損傷后PKCα蛋白水平表達(dá)在SelS低表達(dá)組較損傷前升高（0．63±0．04 vs0．35±0．02，P<0．01）；而未轉(zhuǎn)染組（0．35±0．02 vs0．33±0．03）、空載體轉(zhuǎn)染組（0．36±0．05 vs0．35±0

15、．03）及SelS高表達(dá)組（0．39±0．04vs0．37±0．04）在損傷前后則無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0．05）。 結(jié)論： 1．高表達(dá)SelS可以明顯減弱H2O2對內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制作用，減少氧化應(yīng)激時MDA的生成，增強(qiáng)SOD活力，對內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。 低表達(dá)SelS可以明顯增強(qiáng)H2O2對內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制作用，增加氧化應(yīng)激時MDA的生成，減低SOD活力，加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷。 2．SelS保護(hù)ECV304