活性氧在鼠血管增齡性變化中的作用及脫氫表雄酮的干預(yù)研究.pdf

1、本研究以H202為ROS的代表，圍繞著以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究： 一、三丁基過(guò)氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)衰老及DHEA的干預(yù)作用 本研究以目前公認(rèn)的衰老標(biāo)志物：衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性和細(xì)胞的增殖能力為主要觀(guān)察指標(biāo)，首先對(duì)t-BHP誘導(dǎo)VSMC衰老的可能性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀(guān)察。β-半乳糖苷酶活性采用

2、免疫化學(xué)染色方法，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期來(lái)反應(yīng)細(xì)胞增殖能力，并檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)丙二醛(Maleic Dialdehyde，MDA)的含量。結(jié)果表明經(jīng)80mmol/L的t-BHP持續(xù)作用72h后，VSMC出現(xiàn)了衰老的表型，G0/G1期細(xì)胞的比例和SA-β半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比增加，部分細(xì)胞已發(fā)生凋亡和壞死，細(xì)胞內(nèi)MDA顯著增加，從而表明t-BHP成功誘導(dǎo)了VSMC衰老。這提示ROS是引起血管細(xì)胞衰老的重要機(jī)制之一。 此外，同

3、單用t-BHP處理細(xì)胞相比，在t-BHP處理前給予100nmol/L DHEA，能有效減少衰老表型VSMC比例，G0/G1期細(xì)胞的比例和SA-β半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比減少，凋亡和壞死細(xì)胞亦顯著減少，細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著降低。提示預(yù)防性使用一定劑量的DHEA能延緩ROS引起的VSMC衰老，這種作用部分是通過(guò)抗氧化作用達(dá)到的，這可能是DHEA作用的一種共性機(jī)制。 二、大鼠動(dòng)脈ROS相關(guān)物質(zhì)的增齡性變化及DHEA干預(yù)作用

4、 為進(jìn)一步探討ROS與血管增齡性變化的關(guān)系及其在血管衰老中的作用，我們從動(dòng)物模型角度觀(guān)察了增齡過(guò)程中血管ROS相關(guān)物質(zhì)的變化情況。實(shí)驗(yàn)用Wistar大鼠，分3N：12月齡組、18月齡組、DHEA干預(yù)組(18月齡，12月齡時(shí)開(kāi)始在喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料中添加DHEA 1 mg/kg·d)。取胸主動(dòng)脈，比色法測(cè)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的活性和MDA含量，western blot法測(cè)-氧化氮合酶(endothe

5、ilial Nitric oxide sythase，eNOS)蛋白表達(dá)，Griess法測(cè)定-氧化氮(Nitric oxide，NO)含量，放射免疫法測(cè)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic Guanosinemonophosphate，cGMP)含量。 結(jié)果顯示與12月齡鼠組比較：(1)18月齡鼠動(dòng)脈中，反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度高低的MDA含量明顯升高，而反映清除氧自由基的能力的抗氧化酶SOD活性顯著降低；(2)18月齡鼠主動(dòng)脈中eNOS的蛋白表

6、達(dá)顯著減少，NO含量和cGMP含量明顯降低；給予DHEA干預(yù)的18月齡鼠組上述變化均明顯改善。這些結(jié)果表明隨著增齡，鼠血管本身抗氧化酶活性減弱，對(duì)ROS的清除能力降低，脂質(zhì)過(guò)氧化的程度加重；與此同時(shí)，血管中eNOS的蛋白表達(dá)呈顯著降低的趨勢(shì)，NO產(chǎn)生減少，對(duì)ROS清除能力進(jìn)一步降低；由于缺乏足夠的NO的有效激活，VSMC的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶活性降低，使cGMP的含量明顯降低，從而降低了NO的效應(yīng)。以上環(huán)節(jié)參與了隨增齡而發(fā)生的血管功能受損的過(guò)程

7、，從而在血管衰老發(fā)生中起著重要作用。DHEA能改善大鼠動(dòng)脈因增齡引起的ROS相關(guān)物質(zhì)變化，從而可能是延緩血管衰老的一種有效物質(zhì)。 三、鼠VSMC對(duì)H202刺激反應(yīng)的增齡性變化及DHEA干預(yù)作用 在第二部分研究基礎(chǔ)上，我們培養(yǎng)了18月齡和3月齡大鼠的VSMC，比較了不同年齡大鼠VSMC對(duì)急性}t202應(yīng)激反應(yīng)的差異。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的增殖能力，免疫細(xì)胞化學(xué)法分析核因子p 65(NucleaI factor-kappa

8、B p65，NF-kB p 65)核易位情況；RT-PCR法測(cè)單核細(xì)胞趨化因子-1(monocytechemoattractant protein-1，MCP-1)mRNA的表達(dá)；比色法測(cè)細(xì)胞MDA含量。結(jié)果表明18月齡大鼠VSMC增殖能力對(duì)H<,2>O<,2>刺激較3月齡大鼠VSMC有著更強(qiáng)的敏感性，在低濃度H<,2>O<,2>作用時(shí)表現(xiàn)為更強(qiáng)的增殖能力，而在高濃度H<,2>O<,2>作用下更容易發(fā)生增殖力降低、壞死和凋亡。同3月齡組

9、VSMC比較，50 μ mol/L H<,2>O<,2>作用6h，18月齡組VSMC NF-kB核易位率和MCP-1mRNA表達(dá)水平均顯著升高，提示隨著年齡的增加，VSMC在ROS作用下更容易誘導(dǎo)炎癥因子的釋放和誘導(dǎo)VSMC的增殖，從而更容易進(jìn)展為AS。我們同樣觀(guān)察到，給予一定濃度DHEA預(yù)處理，能有效抑制H<,2>O<,2>引起的18月齡鼠VSMC的NF-kB活化和炎癥因子MCP-1 mRNA的表達(dá)，從而進(jìn)一步證實(shí)，DHEA能干預(yù)RO

10、S對(duì)老齡大鼠血管細(xì)胞的損傷，從而可能延緩血管衰老的進(jìn)展。結(jié)論通過(guò)本研究，我們能夠得出以下。 結(jié)論： 1．80mmoI/L的t-BHP持續(xù)作用72h后，VSMC細(xì)胞內(nèi)MDA顯著增加，G0/G1期細(xì)胞的比例和SA-β半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比增加，細(xì)胞發(fā)生了衰老。提示ROS是引起血管細(xì)胞衰老的重要機(jī)制之一。 2．隨著增齡，鼠血管抗氧化酶SOD活性減弱，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加；血管中eNOS的蛋白表達(dá)呈顯著降低

11、，NO產(chǎn)生減少，cGMP的含量明顯降低。這些與ROS密切相關(guān)的物質(zhì)隨增齡所發(fā)生的變化，可能是引起血管衰老發(fā)生的一種重要原因。 3．在H<,2>O<,2>刺激下，18月齡大鼠VSMC增殖能力較3月齡大鼠VSMC有著更強(qiáng)的敏感性，在低濃度H<,2>O<,2>作用時(shí)表現(xiàn)為更強(qiáng)的增殖能力，而在高濃度H<,2>O<,2>作用下更容易發(fā)生增殖力降低、壞死和凋亡。 4．在50 μ mol/L H<,2>O<,2>作用6h下，18月齡大