來(lái)曲唑法和脫氫表雄酮法誘導(dǎo)PCOS大鼠模型的比較研究.pdf

1、多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見(jiàn)的內(nèi)分泌紊亂性疾病，發(fā)病率為5％～10％，占不排卵婦女的75％～80％，它是一種高度異質(zhì)性疾病，病理生理特征和臨床表現(xiàn)具有多樣性，發(fā)病機(jī)制至今未明。典型的臨床表現(xiàn)有卵巢多囊性改變、不孕、肥胖、多毛和痤瘡等，并常伴胰島素抵抗和高脂血癥。PCOS病理生理學(xué)改變極為廣泛，涉及遺傳學(xué)、內(nèi)分泌、糖脂代謝、蛋白質(zhì)代謝和卵巢局部調(diào)控因素等異常變化，是目前婦科

2、內(nèi)分泌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。PCOS患者還易伴有糖尿病、心血管疾病及子宮內(nèi)膜癌等遠(yuǎn)期并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了患者的心理健康和生活質(zhì)量，對(duì)社會(huì)和家庭和諧帶來(lái)了負(fù)面影響。
　　 目前該病多以內(nèi)科治療為主，幾乎不采取手術(shù)治療，收集臨床標(biāo)本來(lái)研究該病的發(fā)病機(jī)制和治療策略非常困難，因此建立合適的大鼠模型，對(duì)PCOS的病因、發(fā)病機(jī)制及診療手段的研究極為重要。
　　 PCOS動(dòng)物模型的建立方法有多種，大多數(shù)模型具有卵巢多囊狀改變，但這些

3、模型多是模擬PCOS某一或某幾方面的病理特征，有些模型甚至出現(xiàn)與PCOS病理特征不符的現(xiàn)象，使得這些模型無(wú)法很好地應(yīng)用于臨床研究。本研究采用來(lái)曲唑灌胃法和脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)皮下注射法建立PCOS大鼠模型，針對(duì)PCOS的兩大內(nèi)分泌特征，分別從大鼠體重、卵巢的形態(tài)、卵巢的體積和相對(duì)質(zhì)量、卵巢組織學(xué)變化、大鼠動(dòng)情周期變化、大鼠性激素水平的變化和卵巢中受體蛋白的表達(dá)量等方面對(duì)兩種PCOS大鼠模型

4、進(jìn)行評(píng)價(jià)，為PCOS的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：
　　 本研究通過(guò)來(lái)曲唑灌胃法和DHEA皮下注射法建立PCOS大鼠模型，分別從大鼠體重、卵巢的形態(tài)、卵巢的體積和相對(duì)質(zhì)量、卵巢組織學(xué)變化、大鼠動(dòng)情周期變化、大鼠性激素水平的變化和卵巢中受體蛋白的表達(dá)量等方面對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為研究PCOS選擇合適的大鼠模型。
　　 材料與方法：
　　 1研究對(duì)象
　　 選取6周齡和23日齡清潔級(jí)雌性SD大鼠各

5、60只，均隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組各20只，分別用于來(lái)曲唑造模法和DHEA造模法。
　　 2實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1飼養(yǎng)條件
　　 清潔級(jí)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～24℃，濕度為40％～60％，每天光照10小時(shí)，自由飲水，喂以顆粒飼料。
　　 2.2來(lái)曲唑建模法
　　 實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃服用來(lái)曲唑1mg·(kg·d)-1，溶于1％羧甲基纖維素(Carboxy Methylated Cellul

6、ose，CMC)中，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠灌胃服用1％CMC，均連續(xù)定時(shí)灌服20日，空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)。
　　 2.3 DHEA建模法
　　 實(shí)驗(yàn)組大鼠背部皮下注射DHEA6mg·(100g·d)-1溶于0.2ml甘油，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠背部皮下注射0.2ml甘油，均連續(xù)皮下注射20日，空白對(duì)照組正常飼養(yǎng)。
　　 2.4建模過(guò)程觀察指標(biāo)
　　 每日觀察大鼠精神狀態(tài)，并對(duì)各組大鼠進(jìn)行陰道涂片后行巴氏染色，觀察動(dòng)情周期；

7、每三日稱量并記錄大鼠體重，繪制大鼠體重增長(zhǎng)曲線圖。
　　 2.5標(biāo)本的采集和處理
　　 第21日對(duì)所有大鼠稱重后行乙醚麻醉，快速心臟取血法致死（對(duì)照組選取在其動(dòng)情間期）。取血清置-20℃凍存?zhèn)溆?，取出雙側(cè)卵巢稱重后用游標(biāo)卡尺測(cè)量其長(zhǎng)度(A)、寬度(B)和厚度(C)；一側(cè)卵巢置于10％甲醛固定，另一側(cè)卵巢用PBS沖洗后置-80℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2.6檢測(cè)指標(biāo)
　　 2.6.1卵巢體積和相對(duì)質(zhì)量
　　

8、 根據(jù)橢圓形體積計(jì)算公式V(mm3)=0.52×A×B×C計(jì)算大鼠卵巢體積；根據(jù)卵巢重量和大鼠體重計(jì)算卵巢相對(duì)質(zhì)量，即質(zhì)量(mg)/體重（g）×10-3。
　　 2.6.2卵巢組織學(xué)檢查
　　 以大鼠卵巢最大平面為待檢平面進(jìn)行石蠟包埋，每個(gè)蠟塊以4μm厚度切片兩次，進(jìn)行HE染色。
　　 2.6.3大鼠血清學(xué)檢測(cè)
　　 應(yīng)用放射免疫法( Radioimmunoassay,RIA)測(cè)定大鼠血清中促黃體生成激

9、素（Luteinizing Hormone，LH）、卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）、雌二醇（Estradiol，E2）、孕酮(Progesterone，P)和睪酮(Testosterone，T)水平。
　　 2.6.4卵巢中受體蛋白檢測(cè)
　　 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)大鼠卵巢中雄激素受體(Androgen receptor,AR)和黃體生成素受體(Luteinizing ho

10、rmone receptors，LHR)定位表達(dá)；應(yīng)用Western blot法檢測(cè)各組大鼠卵巢中AR和LHR相對(duì)表達(dá)量。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 選用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以(-x)±s表示。計(jì)量資料兩均數(shù)差異的比較采用方差齊性檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用單因素方差分析和多重比較中的LSD法，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1大鼠一般情況：各組大鼠建模

11、過(guò)程中狀態(tài)良好、反應(yīng)靈敏、體毛潤(rùn)澤。
　　 2大鼠體重和動(dòng)情周期的變化：①來(lái)曲唑法實(shí)驗(yàn)組大鼠體重增加量明顯高于兩對(duì)照組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠在灌胃12日后全部失去規(guī)律性動(dòng)情周期，均處于動(dòng)情間期時(shí)相。②DHEA法實(shí)驗(yàn)組大鼠體重增加量和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)情周期變化極不規(guī)律，至處死之日仍未完全失去規(guī)律性動(dòng)情周期。③對(duì)照組大鼠保持規(guī)律的動(dòng)情周期。
　　 3卵巢形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、體積和相對(duì)質(zhì)量

12、變化：①來(lái)曲唑法實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢表面蒼白、包膜增厚，可見(jiàn)大量囊狀卵泡形成；組織學(xué)檢查卵巢顆粒細(xì)胞層減至2-3層，間質(zhì)細(xì)胞明顯增生，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞多數(shù)缺失，少見(jiàn)排卵前卵泡和黃體；實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢體積和相對(duì)質(zhì)量明顯大于兩對(duì)照組（P＜0.05）。②DHEA法實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢表面蒼白，囊狀卵泡凸起不明顯；卵巢組織學(xué)檢查可見(jiàn)顆粒細(xì)胞層減少和白膜增厚，但間質(zhì)增生不明顯；實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢體積明顯小于兩對(duì)照組(P＜0.05)，三組大鼠卵巢相對(duì)質(zhì)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義(P＞0.05)。③對(duì)照組大鼠卵巢顏色紅潤(rùn)、表面光滑，顆粒細(xì)胞呈多層，可達(dá)8-9層。
　　 4大鼠性激素水平變化：①來(lái)曲唑法實(shí)驗(yàn)組大鼠血清LH、T濃度，LH/FSH顯著高于兩對(duì)照組，F(xiàn)SH、P、E2濃度顯著低于兩對(duì)照組(P＜0.05)；②DHEA法實(shí)驗(yàn)組大鼠血清T、E2濃度顯著高于兩對(duì)照組，血清FSH濃度明顯低于兩對(duì)照組(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中LH、P水平及LH/FSH與兩對(duì)照組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。<